硝化作用是氨被微生物氧化為硝酸鹽的過(guò)程，硝化作用是自然界中連接氧化態(tài)和還原態(tài)無(wú)機氮庫的唯一生物學(xué)過(guò)程，在維持全球氮素平衡中起著(zhù)關(guān)鍵作用分別由氨氧化微生物(AOB和AOA)和亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)主導完成。論文研究了幾種不同的經(jīng)過(guò)純培養的硝化細菌(Candidatus Nitrospira nitrosa、Candidatus Nitrospira nitrificans和Candidatus Nitrospira inopinata)和一種未經(jīng)過(guò)純培養的細菌(類(lèi)Nitrospira)，它們都具備單獨將氨氧化為硝酸鹽的能力，這些微生物被定義為全程氨氧化微生物(Comammox)。本論文主要就微生物的硝化反應動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行相關(guān)研究，研究過(guò)柱中主要應用了微呼吸系統結合氧電極測試這幾種硝化微生物菌的硝化過(guò)程以及結合測試體系中氧濃度的變化情況來(lái)判斷這些微生物菌在低營(yíng)養環(huán)境中的硝化反應的動(dòng)力學(xué)

Unisense微電極分析系統的應用

應用unisense微電極分析系統測試，結合一個(gè)2ml的玻璃微呼吸瓶，其中使用微呼吸氧電極的尖端為500um，其中氧電極在使用前已經(jīng)極化了7天，其中玻璃材質(zhì)的微呼吸瓶放置在循環(huán)水浴鍋中，使用氧氣微電極測試生物的微呼吸速率。其中食心蟲(chóng)網(wǎng)螟微生物的微呼吸測試的環(huán)境溫度為37度，螨蟲(chóng)的呼吸速率是在42度的環(huán)境下，微呼吸瓶中放有培養基，培養基靠近微呼吸瓶的注釋器的針尖端，這樣可以確保微呼吸瓶中的不會(huì )形成頂部空間，微呼吸瓶中還放有攪拌子，攪拌速度為200-400rpm的轉速。

實(shí)驗結果

銨鹽和亞硝酸鹽氧化被認為是通過(guò)氨氧化細菌（AOB）以及氨氧化古菌(AOA)和亞硝酸鹽氧化菌共同作用完成的。研究發(fā)現硝化螺菌屬有全程氨氧化菌(comammox)，該菌屬可以獨將氨轉化成硝酸鹽，孤立的進(jìn)行comammox細菌和inopinata硝化螺菌屬的純培養，發(fā)現他們能夠適應于貧瘠和動(dòng)態(tài)棲息地環(huán)境下緩慢生長(cháng)，是基于這類(lèi)菌對氨的高親和力和低的最大氨氧化速率，而與規范氮化物收益率相比具有高增長(cháng)率，替代新陳代謝的基因潛力。對來(lái)自于土壤的和溫泉AOA菌的硝化動(dòng)力學(xué)比較。我們發(fā)現AOA與全程氨氧化菌(comammox)相比，在貧營(yíng)養的環(huán)境中并不具備很好的氨氧化性能，而N.inopinata菌與銨鹽底物具有很好的親和力.這表明全程氨氧化微生物（comammox）在貧瘠和動(dòng)態(tài)環(huán)境條件下能夠發(fā)生硝化作用,能夠將銨鹽直接轉換為硝酸鹽。

圖1、N.inopinata細菌和三種氨氧化奇古菌的氨的氧化動(dòng)力學(xué)研究。a-d代表的是不同氨氧化菌的中在不同濃度的氨鹽環(huán)境下的氨氧化速率。其中圖a表示的是N.inopinata細菌，圖b表示的是Nirospira gargensis氨氧化菌，圖c表示的是Nirospira viennesis菌；圖d表示的是Ca Nitrosotenuis uzonesis菌。從圖中可以看出，隨著(zhù)氨鹽濃度的增加，不同氨氧化菌進(jìn)行氨氧化的速率呈現非線(xiàn)性關(guān)系，先增長(cháng)后慢慢趨于平衡。而體系中銨的濃度檢測是基于氧消耗計算出來(lái)的。

圖2、N.inopinata菌的亞硝酸鹽氧化動(dòng)力學(xué)研究。亞硝酸鹽的氧化速率是基于亞硝酸微傳感器計算出來(lái)的，而亞硝酸微傳感器是通過(guò)微呼吸電極測試環(huán)境中的氧的消耗情況以及培養基底物濃度的變化斜率換算出亞硝酸鹽的濃度變化。其中半飽和參數和亞硝酸鹽的最大銨氧化速率是結合Michaelis-Menten反應動(dòng)力假說(shuō)方程非線(xiàn)性擬合得出的。其中紅色的線(xiàn)代表的是擬合線(xiàn)，圓點(diǎn)代表的是實(shí)際測試數據點(diǎn)。

圖3、不同的總銨濃度對于三種氨氧化菌（Nitrospira inopinata,Nitrososphaera gargensis,Nitrosospira spp）的氨氧化速率的影響。其中氨氧化速率是通過(guò)氨氧化動(dòng)力反應過(guò)程來(lái)表達的。其中Nitrospira inopinata菌和Nitrososphaera gargensis菌的氨氧化速率是基于動(dòng)力學(xué)參數計算獲得的。Km(app)（半飽和參數）and Vmax（最大銨氧化速率）是基于Michaelis-Menten反應動(dòng)力假說(shuō)方程非線(xiàn)性擬合獲得的。

圖4、N.inopinata isolate菌的掃描電鏡形態(tài)圖以及其硝化活性性能分析。其中圖a表示的是N.inopinata isolate菌的掃描電鏡形態(tài)圖，從圖中可以看出，該菌的直徑大約為0.2~0.3微米，圖b表示的不同時(shí)間段內的1mM的銨鹽轉換為硝酸鹽以及其中間產(chǎn)物亞硝酸鹽的近化學(xué)計量比圖。該圖是經(jīng)過(guò)了三次重復實(shí)驗后獲得的。

圖5、N.inopinata and N.gargensis菌的氨氧化活性的最佳溫度。其中圖a表示的是N.inopinata菌在不同溫度環(huán)境下的氨氧化活性研究。圖b表示的是N.gargensis菌在不同溫度環(huán)境下的氨氧化活性研究。從圖中可以看出，N.inopinata菌的氨氧化活性最適宜溫度是37度，而N.gargensis菌的最佳適宜溫度是46度。

Unisense微電極分析系統在研究中發(fā)揮的作用：

本論文主要是就微生物的單步硝化和全程氨氧化作用的過(guò)程及硝化反應動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究，研究了硝化螺菌屬下屬的三種全程氨氧化菌（cmammox）的硝化反應的動(dòng)力學(xué)研究，論文主要是就體系中的總氨的濃度變化來(lái)判斷微生物菌硝化反應的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，具體方法是將相關(guān)全程氨氧化菌微生物放置于2ml的微呼吸瓶中，同時(shí)配合unisense公司開(kāi)發(fā)的氧微呼吸電極，用于檢測微呼吸瓶中氧的濃度變化情況，通過(guò)氧濃度的變化換算出體系中微呼吸瓶的頂端密封有一個(gè)可以添加物質(zhì)的針頭，用于補加胺鹽或亞硝鹽類(lèi)物質(zhì)，這也方便了可以進(jìn)行不同銨鹽的含量對于全程氨氧化菌微生物的硝化性能的影響。微呼吸系統用于微生物的硝化反應動(dòng)力學(xué)的研究是一個(gè)很好的研究創(chuàng )新，發(fā)揮了微電極分析系統能夠實(shí)時(shí)監測、精度高、相應快的優(yōu)點(diǎn)，這也首次開(kāi)拓了unisense微電極分析系統在微生物的硝化動(dòng)力學(xué)的領(lǐng)域研究。

總結

硝化、氨氧化(NH3)形成亞硝酸鹽(NO2?）氧化形成硝酸鹽(NO3?),這個(gè)過(guò)程是地球化學(xué)氮的生物循環(huán)的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。單步硝化作用和全程氨氧化微生物的發(fā)現終結了傳承百年的分布硝化理論，并引發(fā)了眾多關(guān)于全球氮素循環(huán)的重要科學(xué)問(wèn)題，如這些微生物在環(huán)境中的生態(tài)位點(diǎn)及其在硝化作用中的相對貢獻等．本論文就幾種全程氨氧化細菌的單步硝化作用及其硝化動(dòng)力學(xué)方面展開(kāi)了相關(guān)研究，研究過(guò)程中使用了unisense的氧微呼吸，通過(guò)監控氨氧化細菌在硝化過(guò)程中的氧的消耗來(lái)?yè)Q算出體系中氨的損耗，從而全面解析這類(lèi)全程氨氧化細菌（comammox）在低營(yíng)養環(huán)境下的完整硝化反應過(guò)程及硝化動(dòng)力學(xué)的研究，從整理論文的研究可以看出，正是因為使用了unisense微呼吸研究系統可以全面的檢測環(huán)境中的氧消耗濃度的變化，從而能夠準確的換算出體系中氨的消耗情況，從而能夠對這類(lèi)微生物的硝化反應動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究，該微電極分析系統研究微生物的硝化動(dòng)力學(xué)研究中可以在實(shí)驗過(guò)程中補充銨鹽類(lèi)物質(zhì)，并且不會(huì )影響體系中氧的消耗，這也說(shuō)明該微電極分析系統在微生物硝化反應動(dòng)力學(xué)過(guò)程研究方面存在非常好的應用。