研究簡(jiǎn)介:研究表明，絕經(jīng)前女性的心臟病發(fā)病率低于同齡男性，但這種性別優(yōu)勢在女性絕經(jīng)后消失，這提示內源性雌激素可能具有心臟保護作用。雌激素已被證實(shí)具有多種生物學(xué)效應，其中抗氧化應激是與心臟保護相關(guān)的關(guān)鍵效應之一。雌激素能夠減少心肌中的活性氧種類(lèi)生成，并通過(guò)抑制缺血/再氧合誘導的氧化應激來(lái)減少細胞凋亡。硫化氫（H2S）作為一種新發(fā)現的氣體信號分子，硫化氫在心肌中主要由CSE合成，并且已被證明具有心臟保護作用，其機制之一是抗氧化應激。之前的研究表明，雌激素治療能夠改善氧化應激，恢復因去卵巢手術(shù)導致的大鼠心肌中CSE表達和硫化氫生成的降低，提示雌激素可能通過(guò)維持心肌中CSE的表達來(lái)保護心肌細胞免受氧化應激的損害。

本研究旨在證實(shí)CSE有助于17β-雌二醇(E2)對心肌細胞氧化應激的心臟保護作用，并闡明亞型雌激素受體在E2對CSE的調控中的作用。由于Sp-1與多種細胞中CSE的調控有關(guān)，而已知雌激素可調控心肌中的多種miRs，因此研究人員進(jìn)一步確定Sp-1是否介導了雌激素對CSE的調控，并確定心肌中調控CSE的miRs。

Unisense微呼吸系統的應用

使用微型硫化氫微呼吸瓶(型號H2S-MRCh；Unisense)和Unisense PA2000放大器測量了原代培養的大鼠新生心肌細胞產(chǎn)生硫化氫的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)。收集心肌細胞并在不含FBS的培養基中清洗，培養基中用20mM HEPES代替碳酸氫鈉，以防止封閉的微呼吸瓶腔室(Unisense)中形成二氧化碳氣泡。最終細胞團以1×107個(gè)細胞/毫升的濃度重懸，并將0.1毫升細胞懸液注入呼吸瓶。此外，為避免硫化氫自發(fā)氧化，在加入心肌細胞之前，用氮氣對呼吸室中的培養基進(jìn)行脫氧。微電極信號穩定后，加入L-半胱氨酸(1mmol/L，CSE的底物)和5-磷酸吡哆醛(1mmol/L，CSE的輔助因子)以刺激硫化氫生成。在添加底物和輔助因子后，在每個(gè)跡線(xiàn)的最初最陡斜坡處測定硫化氫生成率。細胞活力通過(guò)胰藍排除法進(jìn)行評估，在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，細胞活力保持在90%以上。每次實(shí)驗后，根據制造商的手冊，使用與實(shí)驗相同的緩沖液和條件，用新鮮制備的缺氧硫化鈉原液(0-100μmol/L)校準硫化氫微電極。

實(shí)驗結果

研究發(fā)現雌激素17β-雌二醇（E2）通過(guò)與雌激素受體α（ERα）結合，在體外培養的心肌細胞和雌性小鼠體內上調了CSE的表達。E2能夠降低心肌細胞中miR-22的表達。miR-22是一種微小RNA，能夠靶向ERα和Sp-1，調控它們的表達水平。E2通過(guò)降低miR-22的表達，間接促進(jìn)了特異性蛋白-1（Sp-1）的表達。Sp-1是一種轉錄因子，能夠結合到CSE基因啟動(dòng)子區域的保守位點(diǎn)上，從而促進(jìn)CSE基因的轉錄和表達。由于Sp-1的上調，CSE基因的表達得到了增強，導致心肌細胞中硫化氫的產(chǎn)生增加。硫化氫的增加有助于提高心肌細胞的抗氧化防御能力，從而保護心肌細胞免受氧化應激的損傷。E2通過(guò)上述機制，增強了心肌細胞對H2O2和缺氧/再氧合（H/R）誘導的損傷的抵抗力，顯示出心臟保護作用。揭示了雌激素在性別差異心臟病發(fā)病率中可能發(fā)揮的分子機制，尤其是在絕經(jīng)前女性中觀(guān)察到的較低心臟病發(fā)病率。

圖1、CSE抑制劑減弱E2介導的原代培養新生大鼠心肌細胞氧化應激保護作用。在無(wú)CSE抑制劑(PAG，1mmol/L)或有CSE抑制劑存在的情況下，用E2(10nmol/L)培養細胞24小時(shí)。然后將細胞暴露于H2O2(200μmol/L)中4小時(shí)。通過(guò)MTT(A)和上清液LDH濃度(B)評估細胞的整體存活率。通過(guò)Western blot分析確定裂解的Caspase-3(C)和磷酸化的Akt(D)水平。

圖2、CSE siRNA可減弱E2-介導的原代培養新生大鼠心肌細胞氧化應激保護作用。用對照siRNA或CSE siRNA預處理細胞24小時(shí)，然后用或不用E2(10nmol/L)孵育24小時(shí)。A-D，然后將細胞暴露于H2O2(200μmol/L)4小時(shí)。E-H，然后將細胞放入厭氧室，用92%N2、5%CO2和3%O2凈化24小時(shí)，然后復氧2小時(shí)。通過(guò)MTT(圖A和E)和上清液LDH濃度(圖B和F)評估整體細胞活力。通過(guò)Western印跡法測定裂解的Caspase-3(圖C和圖G)和磷酸化的Akt(圖D和圖H)水平。

圖3、E2在原代培養的新生心肌細胞中介導E2對CSE表達的調節。A，用指定劑量的E2刺激細胞24小時(shí)。采用定量實(shí)時(shí)RT-PCR和Western印跡分析分別測定心肌細胞(n=4)中CSE mRNA和蛋白的表達。B，用E2(10nmol/L)刺激細胞24小時(shí)。實(shí)時(shí)硫化氫生成測量用于確定硫化氫生成率，如材料和方法中所述(n=3)。C，在無(wú)或有非特異性ER拮抗劑ICI 182780(1μmol/L)、ERα特異性拮抗劑MPP(1μmol/L)或ERβ特異性拮抗劑THC(1μmol/L)的情況下，用E2(10nmol/L)處理細胞24小時(shí)。定量實(shí)時(shí)RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定心肌細胞(n=4)中CSE mRNA表達和蛋白表達。D，用對照siRNA或ERαsiRNA轉染細胞24小時(shí)，然后用E2(10nmol/L)處理24小時(shí)。采用實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析和Western印跡分析分別測定心肌細胞中CSE mRNA表達和蛋白表達(n=4)。E，對雌性小鼠進(jìn)行雙側卵巢切除術(shù)以清除內源性雌激素。外源性E2和ERα選擇性激動(dòng)劑(PPT)和ERβ選擇性激動(dòng)劑(DPN)均持續給藥4周。采用Western印跡分析測定心肌中CSE蛋白的表達(每組8人)。

圖4、Sp-1在大鼠心肌細胞中介導E2對CSE的上調。A，蛋白合成抑制劑(CHX)對E2誘導的CSE mRNA表達的影響。用CHX(10μmol/L)預處理原代培養的新生心肌細胞1小時(shí)，然后用E2(10nmol/L)刺激24小時(shí)。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR定量評估CSE mRNA的穩態(tài)水平。B、E2對Sp-1表達的影響。用指定劑量的E2處理原代培養的新生兒心肌細胞24小時(shí)。定量實(shí)時(shí)RT-PCR和Western印跡分析分別用于檢測Sp-1mRNA表達和蛋白表達。C，ERα介導E2誘導的Sp-1表達。用對照siRNA或ERαsiRNA轉染原代培養的新生兒心肌細胞24小時(shí)，然后用E2(10nmol/L)處理24小時(shí)。D，Sp-1在E2上調CSE表達中的作用。用對照siRNA或Sp-1 siRNA轉染原代培養的新生兒心肌細胞，然后用E2(10nmol/L)處理24小時(shí)。E，E2對大鼠CSE啟動(dòng)子活性的影響。用大鼠CSE啟動(dòng)子-熒光素酶報告構建體pGL3-CSE或突變構建體pGL3-CSE SP1轉染H9c2細胞，然后暴露于E2 24小時(shí)。使用雙熒光素酶報告實(shí)驗分析啟動(dòng)子活性。實(shí)時(shí)定量RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定CSE或Sp-1 mRNA表達和心肌細胞蛋白表達(n=4)。

圖5、E2療法對卵巢切除大鼠心肌中miR22、ERα和Sp-1表達的影響。對雌性大鼠進(jìn)行雙側卵巢切除術(shù)，以消耗內源性雌激素。外源性E2給藥8周。定量實(shí)時(shí)RT-PCR和Western印跡分析分別用于測定miR-22的表達(A)以及ERα和Sp-1的蛋白表達(B)。條形圖內的圓圈表示每組的人數。所有條形圖均代表平均±SEM，代表性的Western印跡條帶位于相應圖的頂部。D，用線(xiàn)性回歸法分析miR-22與Sp-1水平的相關(guān)性。E，線(xiàn)性回歸法分析ERα與Sp-1水平的相關(guān)性。

結論與展望

硫化氫主要通過(guò)胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)在心肌中產(chǎn)生，具有心臟保護作用。前期的研究表明，雌激素可以增強雌性大鼠心肌中CSE的表達。本研究旨在探討雌激素調節CSE表達的機制，特別是闡明雌激素受體亞型的作用以及負責雌激素作用的轉錄因子。研究發(fā)現CSE抑制劑或CSE小干擾RNA減弱了17β-雌二醇(E2)對原代培養的新生兒心肌細胞中H2O2-和缺氧/復氧引起的損傷的保護作用。E2在體外培養的心肌細胞和體內雌性小鼠的心肌中通過(guò)雌激素受體(ER)-α刺激CSE表達。在大鼠CSE啟動(dòng)子中鑒定出特異性蛋白1(Sp-1)共有位點(diǎn)，并發(fā)現該位點(diǎn)介導E2誘導的CSE表達。E2增加卵巢切除大鼠心肌中ERα和Sp-1的表達并抑制microRNA(miR)-22的表達。在原代心肌細胞中，E2通過(guò)ERα介導的miR-22下調來(lái)刺激Sp-1表達。已證實(shí)ERα和Sp-1都是miR-22的靶標。在卵巢切除大鼠的心肌中，miR-22的水平與CSE、ERα、Sp-1和抗氧化生物標志物呈負相關(guān)，與氧化生物標志物呈正相關(guān)。使用Unisense微呼吸測量系統，研究人員能夠準確地測量和分析硫化氫的產(chǎn)生，這對于理解雌激素對心臟的保護機制以及CSE在其中的作用至關(guān)重要?？傊狙芯勘砻?，雌激素通過(guò)ERα介導的心肌細胞miR-22下調來(lái)刺激Sp-1，導致CSE上調，進(jìn)而導致抗氧化防御增強。ERα、miR-22和Sp-1的相互作用可能在雌性大鼠心肌氧化應激狀態(tài)的控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。