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2結果與分析
2.1冷凍對原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖 3 未經(jīng)冷凍處理(a)與經(jīng)冷凍處理(b)的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)形成的 Ca2+、Na+脈沖信號
未經(jīng)冷凍和經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+脈沖信號(以電極電位表示，下同)如圖3所示。由圖3(a)可知，未經(jīng)冷凍處理的Ca2+、Na+信號在原生質(zhì)體破裂前電位相對平穩，對應背景離子濃度。當原生質(zhì)體開(kāi)始破裂時(shí)，其周?chē)腃a2+濃度明顯上升，直至離子濃度達到一個(gè)峰值，這段時(shí)間為T(mén)1，計算得到T1=(11.5±2.2)s。之后隨著(zhù)Ca2+慢慢向周?chē)鷶U散，Ca2+濃度慢慢開(kāi)始下降，直至趨于平穩，回復到背景濃度。整個(gè)過(guò)程結束后形成了一個(gè)向上的脈沖信號。這個(gè)脈沖信號為一個(gè)單一的脈沖，沒(méi)有疊加其他細節，表明原生質(zhì)體內Ca2+濃度分布比較均勻。Na+濃度脈沖信號與此類(lèi)似，原生質(zhì)體開(kāi)始破裂到達到峰值所用時(shí)間為t1，計算得到t1=(4.0±0.98)s。圖3(b)為經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。與圖3(a)對比發(fā)現，經(jīng)冷凍處理后，Ca2+的脈沖信號發(fā)生了明顯變化。雖然在破裂前Ca2+的濃度仍保持在背景濃度上，但當原生質(zhì)體開(kāi)始破裂時(shí)，經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體周?chē)腃a2+濃度并未像未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體那樣快速上升，反而先顯著(zhù)地下降達到一個(gè)最低點(diǎn)，緊接著(zhù)才迅速上升，在Ca2+濃度脈沖的前沿處形成一個(gè)明顯的“凹陷”，從原生質(zhì)體破裂到凹陷恢復所用時(shí)間為T(mén)2，經(jīng)計算得到T2=(11.3±1.5)s，形成凹陷的深度為H，計算得H=(16.9±2.4)mV，從原生質(zhì)體破裂到脈沖最高點(diǎn)所用時(shí)間T1’=(19.8±3.0)s。而經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體的Na+的濃度脈沖信號則與未經(jīng)處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)的離子信號情況基本相同，沒(méi)有出現前沿凹陷的現象，t1’=(3.9±1.0)s。經(jīng)對比發(fā)現，經(jīng)冷凍處理后的Ca2+濃度脈沖從原生質(zhì)體破裂開(kāi)始至到達峰值所有的時(shí)間T1大于未經(jīng)冷凍處理的Ca2+濃度脈沖的相應值，兩者間存在顯著(zhù)差異(P<0.01)，相差約8 s；而Na+濃度脈沖在冷凍前后t1幾乎沒(méi)有變化(二者無(wú)統計學(xué)差異，P>0.05)。
經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體，其破裂時(shí)形成Ca2+濃度脈沖信號前沿出現顯著(zhù)的凹陷現象，說(shuō)明原生質(zhì)體中的Ca2+分布不再均勻，靠近細胞中心濃度較高，而細胞膜附近濃度較低，產(chǎn)生了分層現象。
原生質(zhì)體在低滲液吸水而膨脹破裂的。由于在這一過(guò)程中有水滲透進(jìn)原生質(zhì)體，如果原生質(zhì)體內的Ca2+不能很快擴散進(jìn)這些新滲入的水中，則在原生質(zhì)體中靠近細胞膜處便會(huì )形成一個(gè)Ca2+的低濃度區，這自然會(huì )使脈沖信號的前沿處出現一個(gè)與低濃度區相對應的凹陷。
但從圖3(a)中可知，未經(jīng)冷凍處理蘆薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)，其Ca2+濃度脈沖的前沿處并未出現這種凹陷。這說(shuō)明，未經(jīng)冷凍處理的蘆薈原生質(zhì)體內的Ca2+能夠很快地擴散到滲入原生質(zhì)體內的水中，維持了Ca2+濃度的均勻分布。這也表明，未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體對其內部的Ca2+濃度分布具有很好的調控能力。
經(jīng)過(guò)冷凍后的蘆薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)其Ca2+濃度脈沖信號前沿處出現了凹陷，表明其中的Ca2+流動(dòng)性變差，或者說(shuō)原生質(zhì)體調控Ca2+濃度分布的能力遭到了破壞，使得Ca2+不能很快擴散到滲入的水中去，造成Ca2+濃度分布不均勻，出現了分層現象。
以往人們在研究低溫脅迫或細胞的冷凍保存與復蘇時(shí)，大多集中于研究胞外空間的離子流變化或水結冰時(shí)形成的冰晶對細胞的機械損傷，而沒(méi)有注意到細胞調控Ca2+分布的能力的變化。趙明明等研究了低溫處理后冬青葉片細胞內Ca2+水平變化，結果表明，細胞內Ca2+沉淀隨溫度的降低而有所增加。楊蕊等報道了在4℃下黃楊葉肉細胞中Ca2+和Ca2+-ATPase的變化，處理3～12 h后細胞間隙和液泡中的Ca2+沉淀顆粒較少，而細胞質(zhì)和細胞核內的Ca2+增多，Ca2+-ATPase分布幾乎未受影響，處理24 h后，細胞質(zhì)和細胞核內Ca2+開(kāi)始轉移到細胞間隙和液泡中，Ca2+-ATPase的活性增強。在2018年，雖然Mori等在文章中提到低溫會(huì )引起擬南芥細胞內Ca2+濃度的迅速升高。但這些研究均未提及Ca2+的濃度分布是否出現分層現象。因此，筆者的研究結果對于今后這方面的研究具有一定的借鑒意義。與Ca2+不同，Na+在冷凍處理后其濃度分布沒(méi)有發(fā)生分層的現象，這可能與細胞對Ca2+和Na+分布的調控機制不同，及Ca2+和Na+在細胞抗冷凍反應中的作用有關(guān)，需要作進(jìn)一步的深入研究。
2.2冷凍溫度對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進(jìn)一步研究冷凍溫度對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+濃度分布的影響，將蘆薈原生質(zhì)體冷凍至不同溫度后，研究了其中的Ca2+、Na+濃度分布。
圖4為冷凍至不同溫度的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時(shí)的產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。(a)～(f)的溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。從圖中可以看出，當溫度為18℃、10℃、0℃和-5℃時(shí)Ca2+、Na+的信號脈沖與未經(jīng)冷凍處理的原生質(zhì)體破裂時(shí)的離子信號基本相同，其信號前沿處均未出現凹陷。而當冷凍至-7℃時(shí)，Ca2+脈沖的前沿部分開(kāi)始出現明顯的“凹陷”，原生質(zhì)體中Ca2+分布發(fā)生了改變。溫度降低到-10℃時(shí)，凹陷依然存在。
使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學(xué)方法研究水稻幼苗細胞經(jīng)1℃處理24、48 h后細胞中Ca2+定位分布的變化。研究發(fā)現，處理24 h胞質(zhì)膜內側形成了一圈Ca2+沉淀顆粒，當處理時(shí)間增加到48 h后，液泡中的Ca2+許多也分布在液泡膜的內側，一部分顆粒趨向靠近液泡膜，而液泡中心部分的Ca2+分布似乎有減少的趨勢。謝潮添等同樣使用焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學(xué)方法，研究了2℃下的董棕幼苗葉肉細胞中Ca2+水平及其細胞超微結構的變化，研究表明，未經(jīng)低溫處理的董棕幼苗葉肉細胞，焦銻酸鈣沉淀顆粒大量出現在液泡和細胞間隙中。48 h低溫處理后，細胞基質(zhì)和細胞膜上焦銻酸鈣沉淀增加，葉綠體外膜受損。處理120 h后，焦銻酸鈣沉淀大多分布在胞基質(zhì)和細胞膜上，較少分布在液泡和核基質(zhì)中。葉綠體、核膜和液泡膜嚴重破損，內部結構模糊。上述研究表明，低溫處理有使Ca2+向細胞膜附近聚集的趨勢，這與筆者的發(fā)現似乎剛好相反。不過(guò)，上述研究均使用了焦銻酸鈣沉淀的電鏡細胞化學(xué)方法，測量過(guò)程中細胞中的Ca2+以沉淀方式被析出，而且透射電鏡觀(guān)察需要對細胞進(jìn)行固定，這些都影響了的Ca2+的流動(dòng)性。而筆者所采用的方法則不需要對Ca2+進(jìn)行沉淀析出，也不用對細胞進(jìn)行固定處理，所得的結果應當更接近細胞內Ca2+的真實(shí)分布。
圖4不同冷凍溫度下原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(f)溫度分別為18℃、10℃、0℃、-5℃、-7℃和-10℃。
有趣的是，在各種不同的溫度下，Na+脈沖信號的前沿始終沒(méi)有出現凹陷。這說(shuō)明，冷凍脅迫會(huì )對蘆薈原生質(zhì)體中的Ca2+分布造成影響，但對Na+分布幾乎沒(méi)有影響。
2.3解凍時(shí)間對冷凍處理后Ca2+分布的影響
為了研究解凍時(shí)間對冷凍處理后Ca2+分布的影響，筆者選擇冷凍至-7℃的蘆薈原生質(zhì)體為研究對象。將其解凍不同時(shí)間后，對其Ca2+濃度分布進(jìn)行測量。圖5為蘆薈原生質(zhì)體解凍后1、3和5 h后，其破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號的情況?？梢杂^(guān)察到經(jīng)冷凍處理后的原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”現象在解凍5 h后依然沒(méi)有消失，原生質(zhì)體中的Ca2+濃度分層的現象依然存在。這說(shuō)明，冷凍造成的原生質(zhì)體內Ca2+流動(dòng)的降低，或者說(shuō)原生質(zhì)體對Ca2+濃度的調控能力的下降，并不會(huì )在原生質(zhì)體解凍后馬上恢復，而是會(huì )持續相當長(cháng)的時(shí)間。
2.4 ZnO NPs預處理對冷凍原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖6為經(jīng)不同濃度ZnO NPs預處理后再進(jìn)行冷凍(溫度降至-7℃)的蘆薈原生質(zhì)體，在低滲液中破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。圖中(a)～(d)的ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖6可知，不同濃度ZnO NPs預處理后原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+濃度脈沖曲線(xiàn)在前沿處也都出現了“凹陷”現象。但與未經(jīng)ZnO NPs預處理的情況相比，經(jīng)處ZnO NPs理后Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷程度都明顯減小，凹陷深度H為(1.5±0.78)mV。明顯小于冷凍脅迫下未加ZnO NPs的凹陷深度(16.9±2.4)mV，相差約為15.4 mV，統計分析表明二者存在顯著(zhù)差異(P<0.01)。這說(shuō)明，二者中的Ca2+濃度分布情況有明顯差異，Ca2+濃度分布發(fā)生變化。雖然大量研究都已表明，ZnO NPs對植物細胞具毒性，如破壞膜的完整性，DNA鏈斷裂，抑制葉綠素的形成等。但至少從筆者的研究結果來(lái)看，ZnO NPs預處理對抵抗冷凍所造成的Ca2+流動(dòng)性下降，維持細胞對Ca2+濃度分布的調控能力方面具有一定的積極作用。與前面的情形一樣，Na+濃度脈沖的形狀仍沒(méi)有明顯的變化，沒(méi)有出現前沿凹陷在現象。
圖5解凍后1 h(a)、3 h(b)和5 h(c)后蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+脈沖信號
圖6不同濃度ZnO NPs預處理后冷凍脅迫下原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
2.5 ZnO NPs對冷凍后原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
圖7為蘆薈原生質(zhì)體先經(jīng)冷凍處理(溫度降至-7℃)后，再用不同濃度的ZnO NPs進(jìn)行后處理，最后將其放入低滲液中所測得的Ca2+、Na+濃度脈沖信號。
圖7 ZnO NPs處理解凍后原生質(zhì)體破裂后Ca2+、Na+信號脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
由圖中可以看出一個(gè)十分有趣的現象。解凍后再經(jīng)不同濃度ZnO NPs處理的原生質(zhì)體在低滲液中破裂時(shí)，不但Na+濃度脈沖的前沿處沒(méi)有出現凹陷，Ca2+濃度脈沖前沿處的“凹陷”也消失了。這說(shuō)明，ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中由于冷凍造成的Ca2+濃度分層消失了，ZnO NPs的加入使得Ca2+濃度分布又發(fā)生了新的變化，造成這一現象的具體原因目前還不是十分清楚。
2.6 ZnO NPs對未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+、Na+分布的影響
為了進(jìn)一步探究冷凍前后ZnO NPs處理可使濃度脈沖前沿凹陷深度減小甚至消失這一問(wèn)題，了解原生質(zhì)體內部Ca2+、Na+濃度分布的變化情況。筆者檢測了不同濃度ZnO NPs處理3和18 h的未經(jīng)冷凍的蘆薈原生質(zhì)體破裂過(guò)程中產(chǎn)生的Ca2+、Na+濃度脈沖情況，檢測結果如圖8和圖9所示。
由圖8可知，當ZnO NPs濃度為30、50和70 mg·L-1時(shí)，經(jīng)3 h處理后，蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+、Na+信號中均未出現前沿凹陷的現象。而當ZnO NPs濃度為90 mg·L-1時(shí)，發(fā)現Ca2+濃度脈沖的前沿有輕微的凹陷。另一個(gè)值得注意的現象是，圖8(b)～(d)中，在脈沖上升段的開(kāi)始處，其上升趨勢更加陡峭。而且，隨著(zhù)處理時(shí)間的增加，這種趨勢更加明顯，如圖9所示。
從圖9中可以明顯看出，(a)～(d)中4組脈沖信號的上升段的開(kāi)始處，脈沖上升速度極快，與其后部分的上升速度有明顯區別。筆者統計了未經(jīng)ZnO NPs處理、經(jīng)ZnO NPs分別處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時(shí)間T1和該部分前1/3處時(shí)間T1/3，如圖10所示。
經(jīng)過(guò)比較發(fā)現，未經(jīng)ZnO NPs處理與ZnO NPs處理的Ca2+濃度脈沖其從原生質(zhì)體破裂到達到最大值所用的時(shí)間T1基本一致，而在上升的前1/3處所用的時(shí)間T1/3相差明顯。
這一明顯區別表明，與冷凍造成的原生質(zhì)體內靠近細胞膜處Ca2+濃度下降不同。經(jīng)ZnO NPs處理后的蘆薈原生質(zhì)體中，靠近細胞膜處的很小范圍內，Ca2+濃度有較為明顯的上升趨勢。這說(shuō)明，Ca2+濃度分布與未經(jīng)ZnO NPs處理時(shí)相比發(fā)生了變化，猜想可能是ZnO NPs使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+在細胞膜附近分布較集中，從而導致細胞膜破裂后，在脈沖前沿形成較明顯的濃度變化?？赡苷沁@一現象，使得經(jīng)ZnO NPs預處理的蘆薈原生質(zhì)體，在冷凍后其Ca2+濃度脈沖前沿處的凹陷變淺；也會(huì )使先冷凍再用ZnO NPs進(jìn)行后處理的蘆薈原生質(zhì)體的Ca2+濃度脈沖前沿凹陷消失。這當中的具體機制值得深入研究。經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的ZnO NPs處理，Na+濃度脈沖的形狀依然沒(méi)有明顯變化，沒(méi)有出現前沿凹陷在現象。
圖8不同濃度的ZnO NPs處理3 h后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖9不同濃度ZnO NPs處理18 h后的原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+、Na+濃度脈沖圖注：(a)～(d)中ZnO NPs濃度分別為30、50、70和90 mg·L-1。
圖10未處理、ZnO NPs處理3和18 h的Ca2+濃度脈沖上升部分時(shí)間T1和T1/3
綜上，使用Ca2+離子選擇性微電極檢測了經(jīng)冷凍處理后的蘆薈原生質(zhì)體在低滲液中破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+濃度脈沖信號。研究了冷凍溫度、解凍時(shí)間和ZnO NPs處理等因素對蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布的影響。發(fā)現蘆薈原生質(zhì)體被冷凍至-7℃以下時(shí)，其Ca2+脈沖信號前沿處發(fā)生明顯的“凹陷”，Ca2+分布出現分層現象?？拷毎行臐舛容^高而細胞膜附近濃度較低。這說(shuō)明，冷凍造成蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+的流動(dòng)性下降，原生質(zhì)體對Ca2+濃度分布的調控能力降低。這一現象在原生質(zhì)體解凍5 h后仍未消失。
經(jīng)過(guò)ZnO NPs預處理后再進(jìn)行冷凍的原生質(zhì)體，其脈沖凹陷深度明顯減??；而當用ZnO NPs對解凍后的原生質(zhì)體進(jìn)行后處理時(shí)，Ca2+分層現象消失。這可能是由于ZnO NPs處理使得蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+分布趨近于細胞膜附近導致的。這表明，盡管ZnO NPs對植物細胞具有一定的毒性，但其在防止冷凍造成的Ca2+流動(dòng)性下降，維持細胞Ca2+分布的調控能力方面，仍然具有一定的積極作用。
