以谷氨酸興奮性毒性為主要特征的神經(jīng)毒性損傷，與卒中的發(fā)生、發(fā)展，神經(jīng)元的壞死和細胞的凋亡都存在密切的聯(lián)系，卒中后的再灌注損傷成為目前亟待解決的問(wèn)題。目前已證實(shí)一些神經(jīng)保護劑可減少谷氨酸的釋放，低溫也可降低谷氨酸的釋放，因此了解缺血后谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化有助于認識神經(jīng)細胞壞死的程度，從而為今后延緩或阻止細胞壞死提供藥物治療的評價(jià)依據。卒中后大部分患者經(jīng)受著(zhù)不同程度的偏側癱瘓或運動(dòng)障礙，皮質(zhì)運動(dòng)區負責對側半身的隨意運動(dòng)，卒中引起的對側偏癱表明病灶同側的皮質(zhì)運動(dòng)區產(chǎn)生了病理改變，而皮層的損傷程度為判斷預后提供了幫助。CIRSTEA等也通過(guò)磁共振波譜證實(shí)卒中6個(gè)月后病灶同側正常顯影的灰質(zhì)中的谷氨酸濃度與肢體癱瘓程度呈正相關(guān)，因此谷氨酸的變化也有助于卒中后臨床表現進(jìn)程的研究，從而作為卒中預后指標。

如今，非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物作為臨床前研究的重要實(shí)驗對象，對于靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物缺血后皮層谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化尚少見(jiàn)報道，因此，本研究運用電化學(xué)微電極傳感器技術(shù)檢測活體食蟹猴腦缺血過(guò)程中皮層谷氨酸水平及動(dòng)態(tài)變化，為今后進(jìn)一步探索腦缺血皮層谷氨酸動(dòng)態(tài)變化與卒中臨床表現的關(guān)系提供依據，旨在為谷氨酸成為治療評價(jià)及預后判斷的指標奠定理論基礎。

1.材料與方法

1.1研究對象

所用動(dòng)物來(lái)自廣西南寧靈康賽諾科生物科技有限公司實(shí)驗室(以下簡(jiǎn)稱(chēng)靈康公司)，該實(shí)驗室經(jīng)過(guò)國際動(dòng)物評估認證管理委員會(huì )(AAALAC)認證。選取3只正常食蟹猴，編號為NHP1、NHP2、NHP3,NHP1為雄性，6歲，9.5 kg；NHP2為雌性，9歲，4.2 kg；NHP3為雌性，7歲，4.0 kg。本研究在靈康公司靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物實(shí)驗室進(jìn)行，3只動(dòng)物分別放置在標準單籠(深×寬×高為60 cm×77 cm×75 cm)內飼養，動(dòng)物房溫度22~28℃，相對濕度為30%~75%，12 h/12 h明暗交替，每日早晚兩次喂食標準飼料(碳水化合物0.492 g/g，蛋白質(zhì)0.237 g/g，脂肪0.061 g/g)，中午給予1次新鮮蔬菜或水果，動(dòng)物不限制進(jìn)水。本研究方案已遞交靈康動(dòng)物倫理委員會(huì )(IACUC)審核并獲得批準。

1.2方法

1.2.1主要儀器

FAST-mkⅢ神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)時(shí)檢測系統(美國Quanteon公司)，谷氨酸檢測電極來(lái)自美國肯塔基大學(xué)微電極技術(shù)中心。

1.2.2缺血性腦卒中模型的建立和谷氨酸實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測

實(shí)驗食蟹猴術(shù)前禁食16 h，常規麻醉，舒眠寧(0.03 mL/kg)、阿托品(0.04 mg/kg)肌注，術(shù)中持續異氟烷(1%~3%)吸入麻醉。頭部備皮，常規消毒鋪巾。將左側顴弓上緣水平線(xiàn)與眶外緣垂直線(xiàn)連線(xiàn)交點(diǎn)，和顱骨矢狀線(xiàn)與雙外耳道連線(xiàn)(顱骨映射線(xiàn))交點(diǎn)，兩交點(diǎn)連線(xiàn)即為左側大腦中動(dòng)脈大致走行方向，沿該連線(xiàn)做一長(cháng)切口，依次進(jìn)入皮膚、皮下組織、筋膜、顳肌，翻開(kāi)并去掉部分顳肌，暴露顱骨，以左側顴弓上緣上側與眶外緣后側為邊界做一約20 mm×15 mm顱骨開(kāi)窗(骨窗一)；在同側皮層運動(dòng)區做一約15 mm×10 mm顱骨開(kāi)窗(骨窗二)。在骨窗一，沿大腦外側裂經(jīng)腦棉保護向內游離暴露大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery，MCA)M1段，將MCA M1近端夾閉1 h后放開(kāi)。在骨窗二，將谷氨酸檢測電極固定于立體定向支架上，并連接FAST-16mkⅢ神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)時(shí)檢測系統，獲取夾閉前1 h、夾閉時(shí)1 h及夾閉放開(kāi)后1 h該部位谷氨酸的持續變化，這3個(gè)時(shí)間窗內谷氨酸檢測為連續性的，均在1次手術(shù)中完成。檢測完畢，縫合骨窗一骨瓣，骨蠟密封，保留骨窗二，關(guān)顱縫皮。在術(shù)后第1周和第2周經(jīng)骨窗二進(jìn)行谷氨酸實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測1 h，手術(shù)準備與操作同前，谷氨酸檢測方法已有應用。

1.2.3谷氨酸電化學(xué)檢測

谷氨酸電化學(xué)檢測主要分為校準和檢測。每次實(shí)驗檢測前對所用電極進(jìn)行檢測物(谷氨酸)、干擾物(抗壞血酸)、可能影響物(如過(guò)氧化氫、多巴胺等)比對校準，獲取電極檢測限、靈敏度、特異性、濃度線(xiàn)性擬合(R2)等參數，本實(shí)驗校準參數如下(n=9)：檢測限為(1.18±0.88)μmol/L，靈敏度為(5.3±4.4)pA/(μmol·L)，谷氨酸特異性(谷氨酸氧化反應電流/抗壞血酸還原反應電流)為(9.7±5.7)：1，R2為(0.993 1±0.010 0)。校準后將檢測電極與FAST-16mkⅢ系統連接置于檢測部位，便可用于檢測。

1.2.4谷氨酸檢測位點(diǎn)

選取手術(shù)同側皮層運動(dòng)區的腦回,檢測深度位于腦表面下3 mm，選取的位點(diǎn)已在類(lèi)似研究中應用，具體為耳棒：15.0~20.0 mm，中線(xiàn)：10.0~11.0 mm。該區域為大腦中動(dòng)脈供血區，支配上肢運動(dòng)區域。

2.結果

圖1食蟹猴在夾閉MCA M1的術(shù)前、術(shù)后第1周和術(shù)后第2周的T2WI及MRA影像學(xué)表現

腦缺血過(guò)程中的谷氨酸變化

谷氨酸采集頻率為4 Hz，每個(gè)檢測窗各選取3段30 s檢測濃度進(jìn)行分析，每段之間相隔10~20 min，所得數據由每段檢測濃度的平均值獲得。皮層運動(dòng)區谷氨酸濃度：3只食蟹猴術(shù)前基礎濃度(7.7±6.1)μmol/L，夾閉MCA M1(37.8±25.2)μmol/L，夾閉放開(kāi)(38.3±25.1)μmol/L；術(shù)后第1周(12.2±9.5)μmol/L；術(shù)后第2周(23.7±26.1)μmol/L。在夾閉MCA M1時(shí)或夾閉放開(kāi)后較基礎濃度升高(t=4.200，P=0.003；t=4.25，P=0.003)，夾閉放開(kāi)后較夾閉MCA M1時(shí)谷氨酸濃度變化差異無(wú)統計學(xué)意義(t=0.160，P=0.877)，術(shù)后第1周較夾閉MCA M1時(shí)或夾閉放開(kāi)后谷氨酸濃度明顯下降(t=3.95，P=0.004；t=4.320，P=0.003)，術(shù)后第2周較術(shù)后第1周谷氨酸濃度變化差異無(wú)統計學(xué)意義(t=1.970，P=0.085)。

圖2食蟹猴在夾閉MCA M1后2周內神經(jīng)功能缺損評分的變化

3.結論

本研究使用的FAST-mkⅢ系統，檢測頻率為1~1 000 Hz，檢測電極尖端寬度150μm。相對于微透析技術(shù)，FAST具有創(chuàng )傷性更小、檢測頻率更高、即時(shí)記錄等特點(diǎn)，可以檢測亞秒級的谷氨酸瞬時(shí)變化并即時(shí)記錄，幾乎不存在時(shí)間延遲效應，能夠非常精確地反映腦內神經(jīng)遞質(zhì)的瞬時(shí)變化水平。本研究中各檢測窗還未發(fā)現谷氨酸濃度驟然的起伏，只是在夾閉MCA M1后出現過(guò)緩慢的持續上升過(guò)程。目前的不足之處在于，利用FAST系統進(jìn)行缺血食蟹猴清醒狀態(tài)下長(cháng)期在體檢測的技術(shù)難題仍未解決。

總而言之，本研究活體檢測食蟹猴缺血過(guò)程中皮層谷氨酸的動(dòng)態(tài)變化，或許能夠為卒中進(jìn)展過(guò)程中臨床表現的變化提供評價(jià)依據，為谷氨酸成為卒中治療和判斷預后的指標提供可能。