反硝化厭氧甲烷氧化（DAMO）過(guò)程可以在厭氧條件下同步實(shí)現脫氮和CH4減排。該過(guò)程是一種獨特的反硝化反應，當硝酸鹽或亞硝酸鹽作為電子受體被還原為N2的同時(shí)，CH4作為唯一電子供體被氧化為CO.研究表明，DAMO過(guò)程對海洋沉積物中CH4的消耗減排占據了主導地位，且在濕地、河流、深水湖泊等自然生境以及農業(yè)土壤和廢水中均存在，該過(guò)程在全球碳氮循環(huán)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。DAMO微生物最早在淡水沉積物培養物中富集而得，起主導作用的功能微生物可以分為兩大類(lèi)：NC10門(mén)細菌的Candidatus‘Methylomirabilis oxyfera’（M.oxyfera）和隸屬于A(yíng)NME（anaerobic methanotrophic archaea,厭氧甲烷氧化古菌）中的一個(gè)簇ANME-2d的Candidatus‘Methanoperedens nitroreducens’（M.nitroreducens）。其中，DAMO古菌通常被認為只能將硝酸鹽（NO3-）還原為亞硝酸鹽（NO2-），因此需要與其他微生物協(xié)同作用以達到理想的脫氮效果。目前的研究表明，DAMO古菌可以與DAMO細菌協(xié)同進(jìn)一步將NO2-還原為N2;同時(shí)，也已有研究發(fā)現在污水處理廠(chǎng)中DAMO微生物與厭氧氨氧化（Anammox）細菌共存現象，因此可以共培養DAMO古菌與Anammox細菌形成耦合系統，通過(guò)Anammox細菌進(jìn)一步利用DAMO古菌產(chǎn)生的NO2-作為電子受體?污水中的NH4+作為電子供體產(chǎn)生N2,從而實(shí)現總氮的高效去除和溫室氣體的減量排放。

將硝酸鹽型~DAMO與厭氧氨氧化聯(lián)合應用，能夠在兩類(lèi)優(yōu)勢菌種的協(xié)同作用下將各種形式的氮轉化為N2,同時(shí)實(shí)現總氮去除和CH4減排。然而，在對Anammox-DAMO耦合系統的研究過(guò)程中檢測到了N2O,這說(shuō)明并不是所有的氮都能轉化為N2被去除，而是在脫氮過(guò)程中生成了N2O這一中間產(chǎn)物。迄今為止的研究結果沒(méi)有證據表明厭氧氨氧化細菌在正常代謝過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生N2O1-1.N2O作為反硝化過(guò)程的中間產(chǎn)物，一般認為在DAMO過(guò)程不會(huì )出現，這是因為DAMO微生物的代謝途徑特殊，DAMO細菌利用NO歧化酶將NO轉化為N2和O2,產(chǎn)生的O2再對CH4進(jìn)行氧化，略過(guò)了中間體N2O的生成。雖然DAMO微生物中存在編碼N2O生成及降解的基因，但相關(guān)研究的實(shí)驗結果表明DAMO系統中有少量N2O的產(chǎn)生，然而降解N2O的基因卻未能表達。目前關(guān)于廢水處理過(guò)程中N2O產(chǎn)生的研究大多集中在傳統反硝化工藝，鮮少有人將研究聚焦于DAMO、Anammox等新型脫氮技術(shù)。

溫度變化會(huì )影響與N2O產(chǎn)消相關(guān)的微生物及酶的活性，從而引起N2O積累量的波動(dòng)。有研究者利用A/O SBR反應器探究N2O隨溫度變化的產(chǎn)消情況，發(fā)現在15℃的低溫條件下N2O排放量比25℃時(shí)增加了1.9倍。Anammox與DAMO耦合脫氮過(guò)程中N代謝途徑較為復雜，不同溫度影響下該系統N2O的產(chǎn)消規律如何變化還有待探究。目前關(guān)于污水脫氮工藝中N2O排放的研究多集中在中低溫條件，然而在某些特定的氣候條件下高溫也會(huì )顯著(zhù)影響廢水處理效果。本文以Anammox-DAMO系統為研究對象，探究中、高溫影響下該系統的性能與N2O產(chǎn)消變化規律，通過(guò)分子生物學(xué)手段及動(dòng)力學(xué)機制探明N2O產(chǎn)消的代謝途徑，并提出N2O減排策略。

1材料與方法

1.1試驗裝置

批次試驗使用內徑7.0cm、高14.0cm,有效容積為250mL的厭氧子反應器（圖1）；連續試驗使用內徑16cm、高30cm、容積為3.5L的厭氧母反應器。反應器所有取樣口均設有閥門(mén)，閥門(mén)關(guān)閉時(shí)，反應器呈全封閉狀態(tài)，維持反應器內厭氧狀態(tài)，整個(gè)反應過(guò)程中使用磁力攪拌器進(jìn)行連續攪拌，保證反應器內泥水混合均勻。

圖1試驗裝置

1.2接種污泥與營(yíng)養液

試驗系統為以Anammox菌和DAMO古菌為優(yōu)勢菌種的Anammox-DAMO系統，以西湖底泥?杭州西溪河底泥與農田水稻土壤的混合污泥為接種物，在厭氧條件下供給CH4?NO3-和NH4+,試驗期間系統運行穩定。

營(yíng)養液新鮮配制，使用前氮吹30min以排除O2,組成如下：KH2PO40.05g/L;CaCl2·2H2O 0.3g/L;MgSO4·7H2O 0.2g/L;NaHCO31.05g/L;微量元素含量為1.25mL/L.微量元素包括（g/L）：15 EDTA,0.43 ZnSO4·7H2O,0.24 CoCl2·6H2O,0.99 MnCl2·4H2O,0.25 CuSO4,0.22（NH4）6MoO24·4H2O,0.19 NiCl2·6H2O,0.067 SeO4,0.014 H3BO3,0.05 Na2WO4·2H2O.營(yíng)養液以去離子水為溶劑配制。

1.3試驗方法

1.3.1批次試驗為了研究溫度對系統的短期影響，并建立溫度影響下N2O產(chǎn)消動(dòng)力學(xué)模型，進(jìn)行為期10d的批次試驗。從母反應器中各取200mL泥水混合液注入厭氧子反應器中，各子反應器的NO3-和NH4+起始濃度為20mg/L,CH4濃度為80mg/L,pH=7.0,試驗溫度分別設置為20,25,30,35,40℃，每組設3個(gè)平行。試驗期間，每24h取氣樣3.0mL,水樣3.0mL,經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后測定NO3--N?NO2--N及NH4+-N濃度，同時(shí)監測系統中CH4含量以及N2O濃度變化。

1.3.2連續試驗基于批次試驗結果，篩選出反應效率最優(yōu)以及N2O積累量最多的兩組具有代表性的溫度條件進(jìn)行連續試驗，以揭示溫度對Anammox-DAMO系統的長(cháng)期影響。以DAMO微生物倍增周期25d為一個(gè)實(shí)驗周期進(jìn)行3個(gè)周期實(shí)驗，保持各系統pH值為7.0——7.2.每48h取各反應器水樣5.0mL,氣樣4.0mL,利用紫外分光光度計和氣相色譜儀分別測定NO3--N、NO2--N、NH4+-N、CH4、N2O的含量。以7d為一個(gè)加藥周期，每7d補充一次NO3-、NO2-、CH4.在試驗前中后期分別取泥水混合物30mL,熱提法提取EPS提取液后測量含蛋白質(zhì)（PNs）和多糖（PSs）的胞外聚合物（EPSs）的組成以及濃度變化。在連續試驗前、中、后期分別取5mL污泥樣品進(jìn)行高通量測序分析。

1.4分析方法

NO3--N、NO2--N和NH4+-N濃度使用雙束紫外~可見(jiàn)分光光度計（TU1901）按照標準方法測量。使用氣相色譜儀（GC2030,島津）測量頂空N2O含量以及CH4含量。采用pH計（梅特勒FG2）監測反應器內pH值的變化。采用熱提法分離EPS.PNs和PSs的測定方法分別為福林酚試劑法和蒽酮法。通過(guò)Usearch軟件和Gold數據庫將剩余序列聚集到操作分類(lèi)單元（OTU）中。利用E.Z.N.A.®土壤DNA試劑盒（Omega Bio-tek,美國）進(jìn)行樣品DNA抽提進(jìn)行后續宏基因組測序。Illumina NovaSeq測序平臺用于宏基因組測序。

1.5動(dòng)力學(xué)模型

采用酶動(dòng)力學(xué)方程模擬NO3-、NH4+的還原以及N2O的產(chǎn)生和還原，如式（1）所示。

式中：RER為酶活性函數；Vmax,R為相應還原酶反應的最大比合成/活化速率，d-1;KE,i為酶誘導的半飽和常數，mg/L;KI,R為相應還原酶抑制系數，mg/L;Ci為底物的水相濃度，mg/L;R為還原酶（即Nar、Nir、Nos）；i為相應底物（即NO3-、NH4+、N2O）；CT為溫度變化因素。

2結果與討論

2.1溫度對Anammox-DAMO系統性能及N2O產(chǎn)消的影響

2.1.1溫度對Anammox-DAMO系統性能的影響根據厭氧氨氧化微生物和DAMO微生物的最適生長(cháng)溫度條件4-2,選擇20——40℃進(jìn)行短期試驗，對試驗結果進(jìn)行單因素方差分析。從圖2可見(jiàn)，NO3-、NH4+、CH4的降解速率均隨溫度的升高先增大后減小，而N2O的濃度峰值整體呈現先下降后上升的趨勢。系統在溫度為40℃時(shí)，N2O的濃度峰值達到最大。對溫度影響下的批次實(shí)驗結果進(jìn)行單因素方差分析，發(fā)現40℃溫度條件對N2O排放量的影響最大，另外對各環(huán)境因素進(jìn)行正交實(shí)驗，結果顯示30℃為該系統脫氮性能最優(yōu)的溫度條件，因此將30℃作為對照組，40℃作為實(shí)驗組進(jìn)行長(cháng)期試驗研究，以探明不同溫度條件下Anammox-DAMO系統性能及N2O產(chǎn)消規律。

圖2短期試驗溫度對Anammox-DAMO系統污染物降解及N2O峰值影響

圖3（a）和圖3（b）表明，Anammox-DAMO系統在40℃高溫條件下的脫氮性能要低于30℃，但隨著(zhù)時(shí)間的推移，R2系統的脫氮性能較前期有提升，這說(shuō)明該體系可以逐漸適應高溫的脅迫，這主要歸因于微生物會(huì )在極端環(huán)境下產(chǎn)生特殊的蛋白質(zhì)和酶來(lái)幫助細胞抵御脅迫。有研究表明，瞬時(shí)高溫沖擊會(huì )對Anammox菌的活性產(chǎn)生抑制作用，但長(cháng)期運行下系統的性能逐漸恢復，這說(shuō)明Anammox菌具有緩解高溫抑制的內部機制。R2系統受到高溫的影響，在反應過(guò)程中出現了亞硝酸鹽的積累，平均積累濃度為（1.43±0.47）mg/L.從圖3（c）可知，R2系統中的硝酸鹽、氨氮、CH4降解速率均低于R1系統，說(shuō)明高溫對系統中微生物活性產(chǎn)生了抑制作用，影響了其正常代謝。有研究表明，Anammox活性（SAA）會(huì )隨著(zhù)溫度的升高呈現先升高再降低的趨勢，溫度對Anammox菌群蛋白質(zhì)變化情況的影響也說(shuō)明了Anammox菌的活性在高溫下受到抑制。有研究探究了溫度對Anammox-DAMO共培養系統的影響，結果表明溫度對耦合系統的影響同樣呈先上升后下降的趨勢，在高溫下微生物活性降低8-3.

圖3長(cháng)期試驗溫度對Anammox-DAMO系統中污染物降解影響

在兩個(gè)系統的長(cháng)期運行過(guò)程中均檢測到了硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）反應，DNRA是一個(gè)特殊的生物反應過(guò)程，使用亞硝酸鹽作為中間物將硝酸鹽還原成銨1-3.在R1系統中，硝酸鹽降解速率為0.08mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.05mmol/（L·d），CH4降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率與硝酸鹽降解速率實(shí)際比值（1:2.00）與DNRA反應的理論比值（1:2.10）相符，說(shuō)明在R1系統中同時(shí)存在DAMO、Anammmox、DNRA反應。R2系統中硝酸鹽降解速率為0.06mmol/（L·d），氨氮降解速率為0.04mmol/（L·d），CH4降解速率為0.03mmol/（L·d），也觀(guān)察到了相同的結果，證明了DAMO、Anammmox、DNRA反應的共存。

2.1.2溫度對Anammox-DAMO系統N2O產(chǎn)消的影響由圖4可知，2個(gè)系統均觀(guān)察到了明顯的N2O產(chǎn)消，且R2系統中N2O的總體累積量大于R1系統，其中R1系統N2O平均峰值濃度為（4.86±0.30）mg/L,R2系統為（6.85±0.59）mg/L.

相比于R1系統，R2系統產(chǎn)生了更多的N2O,研究表明，在N-DAMO系統中，nrfA的轉錄水平隨亞硝酸鹽濃度的增加而顯著(zhù)上調，推測在R2系統中DAMO古菌為了應對亞硝酸鹽的脅迫加劇了DNRA反應的發(fā)生。在高濃度亞硝酸鹽影響下DNRA過(guò)程會(huì )生成NO,出于對NO的解毒作用，DNRA將NO轉化為N2O.Pereira在研究操作條件對厭氧氨氧化系統N2O產(chǎn)生的影響過(guò)程中發(fā)現亞硝酸鹽是N2O生成和積累的關(guān)鍵，這主要歸因于A(yíng)OB中由細胞色素P460（CytL）催化的厭氧羥胺（NH2OH）解毒途徑。Ding等也發(fā)現N2O釋放率與亞硝酸鹽濃度呈正相關(guān)，這是因為亞硝酸鹽和N2O會(huì )競爭電子，當用于亞硝酸鹽還原的電子通量高于用于N2O還原的電子通量時(shí)，N2O就會(huì )積累。同時(shí)，在亞硝酸鹽和硝酸鹽共存的情況下，亞硝酸鹽和硝酸鹽還原酶之間對電子供體的競爭也可能導致N2O的不完全還原。另外，由于受到高溫影響，Anammmox細菌活性受到抑制，易造成中間產(chǎn)物NO的積累，為了防止NO對微生物造成毒害作用，Anammox細菌將NO轉化為N2O,因此在R2系統中產(chǎn)生更多的N2O。