內容提要：目的：驗證MED64系統記錄小鼠海馬腦片自發(fā)放電方法可行性，以及觀(guān)察平面微電極陣列技術(shù)應用于抑郁，帕金森，癲癇等研究的優(yōu)勢。方法：通過(guò)MED64系統對正常以及由低鎂高鉀加4-AP誘導的小鼠海馬腦片進(jìn)行記錄，運用Mobius軟件進(jìn)行數據分析。結果：正常ACSF灌注記錄到成年小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電改用4-AP+低鎂高鉀ACSF灌注8min左右后小鼠海馬腦片呈現癲癇樣放電。換回正常ACSF洗脫30min后腦片放電恢復正常，癲癇樣放電逐漸消失。結論：MED64平面微電極陣列技術(shù)可以記錄小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電，運用該技術(shù)成功建立了小鼠海馬腦片癲癇模型。

微電極陣列（Multi-Electrode Array）記錄系統是包括了離體電生理研究所需的一整套硬件設備耗材和分析軟件。自從第一套微電極陣列系統問(wèn)世后，它主要是通過(guò)如何取得更好的胞外記錄信號和增加電極的密度數量上這兩方面來(lái)發(fā)展的。本校中心試驗室的MED64平面微電極陣列是日本Alpha MED Sciences公司研發(fā)的多通道離體電生理記錄系統。它可通過(guò)64個(gè)平面微電極對離體組織或細胞進(jìn)行多通道電生理同步記錄。適用于神經(jīng)、視網(wǎng)膜和心肌細胞電生理特性和離子通道生物學(xué)特性研究。由于同時(shí)記錄腦片多個(gè)神經(jīng)元或可興奮組織的放電，采集數據多，大大地擴展了研究的視野，有助于對整個(gè)神經(jīng)核團或器官的神經(jīng)元之間聯(lián)系和功能的研究。并且由于平面微電極陣列技術(shù)對于細胞來(lái)說(shuō)是無(wú)創(chuàng )性的，這樣既保持了對單細胞的準確記錄，又能記錄對藥物刺激響應的較長(cháng)時(shí)間的演變。這些特點(diǎn)使得其具有不可替代的優(yōu)勢。

目前本校已有多個(gè)神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)PI組對記錄分析活體組織神經(jīng)元自發(fā)性活動(dòng)有迫切需求，尤其是癲癇病研究領(lǐng)域。這就需要建立一套平面微電極陣列記錄離體神經(jīng)組織自發(fā)放電的方法。

1.材料與方法

1.1一般材料

實(shí)驗動(dòng)物：選取清潔級健康成年雄性C57BL/6小鼠，由首都醫科大學(xué)動(dòng)物部提供，實(shí)驗動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2016-0011。實(shí)驗動(dòng)物的使用均按照首都醫科大學(xué)實(shí)驗動(dòng)物中心和北京實(shí)驗動(dòng)物協(xié)會(huì )的標準執行。整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中盡可能地減少對動(dòng)物的傷害及所用動(dòng)物的數量。

試劑：4-氨基吡啶（4-Aminopyridine，4-AP）購自Sigma公司，其余試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

海馬腦片的制備：將小鼠斷頭，迅速剝離出全腦置于冰水混合態(tài)的標準人工腦脊液（Artificial Cerebrospinal Fluid，ACSF）中靜置1min。ACSF的組成（mmol/L）：NaCl 117，KCl 3.6NaH2PO4·2H2O 1.2，MgCl2·6H2O 1.2，CaCl2·2H2O2.5，NaHCO325，D-Glucose 11，pH 7.3～7.4。然后取出鼠腦剝離出海馬組織至于修好的瓊脂凹槽中，用濾紙吸出多余液體后切掉后端小部組織，而后用502膠將海馬組織與瓊脂凹槽固定于組織振動(dòng)切片機（日本Dosaka，DTK1000）浴槽的金屬底板上，切取400μm厚的海馬腦片（以冠狀面切片）。將切好的腦片移至ACSF的孵育槽中，ACSF預先通以95%O2和5%CO2混合氣至氧飽和。室溫下孵育1h后記錄。記錄時(shí)持續灌流氧飽和的ACSF，流速控制在3～4mL/min。

1.3 MED64平面微電極陣列的預準備

本實(shí)驗電生理記錄所采用的MED64 Probe（MED64平面微電極陣列探針，日本Alpha Med Sciences）是在透明石英玻璃（50mm×50mm×1.1mm，Pyrex7059）中心內嵌一個(gè)裝配有64個(gè)（8×8等距陣列）平面微電極的電路板構成（圖1a）[6]。MED64 Probe中心每個(gè)平面微電極的面積是50μm×50μm，間距為150μm（P515A型號）（圖1b）。實(shí)驗中根據組織標本大小，面積的不同可以選擇其適合的電極規格型號。電極使用前需要用含0.1%的聚氮丙啶（Polyethylenimine，PEI）硫化物的硼酸鹽緩沖液包埋處理（12h以上），目的是加強電極表面對腦片組織的黏著(zhù)親和性。

圖1.MED64平面微電極陣列探針（a.MED64Probe；b.8×8等距微電極陣列；c.海馬腦片在電極陣列上的位置）

1.4記錄海馬腦片自發(fā)放電

用寬口吸管將孵育好的海馬腦片移入MED64 Probe。在倒置顯微鏡下先用尼龍蓋網(wǎng)蓋住腦片，然后用鑷子夾住尼龍網(wǎng)將腦片拖至電極陣列記錄位置后蓋上金屬壓片（SHD-22L，美國Harvard）將其固定。用蠕動(dòng)泵（BT100-2J，LongPump）持續灌流通入95%O2和5%CO2混合氣的ACSF（灌流速度3～4mL/min，室溫）。灌流過(guò)程中用CCD顯微照相機（DP70，日本Olympus）采集海馬腦片-MED64電極位置圖像（圖1c）并且排除系統噪聲干擾，將噪聲控制在±10μV以下。灌流20min后使用Mobius軟件對海馬腦片神經(jīng)元的自發(fā)電活動(dòng)信號進(jìn)行同步采樣，采樣率為20kHz[7]。得到正常自發(fā)放電數據后改用4-AP+低鎂高鉀ACSF灌流，以形成癲癇樣放電的海馬腦片（癲癇樣放電達到10次/min以上）。記錄10min后換回正常ACSF洗脫直至癲癇樣放電消失。

2.結果

2.1正常小鼠海馬腦片自發(fā)放電

正常ACSF灌流時(shí)，MED64 Probe64個(gè)通道中僅有個(gè)別通道可以觀(guān)察到海馬腦片少量神經(jīng)元自發(fā)放電（圖2a-1）。通過(guò)Mobius軟件對放電信號通道分析可以提取出不同放電特征的多個(gè)神經(jīng)元（圖2a-2）。

圖2.小鼠海馬腦片放電（a-1.MED64記錄正常小鼠海馬腦片自發(fā)放電；a-2.第29通道海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電；b-1.MED64記錄4AP+無(wú)鎂高鉀ACSF誘導的海馬腦片自發(fā)性癲癇樣放電；b-2.第27通道海馬腦片神經(jīng)元癲癇樣放電）

2.2小鼠海馬腦片癲癇樣放電

灌流4-AP+低鎂高鉀ACSF大約8min左右（（500±50）s，n=6）海馬腦片神經(jīng)元開(kāi)始出現簇狀密集的癲癇樣放電（圖2b-1）。在出現相對大的癲癇樣放電事件之前會(huì )先觀(guān)察到一些通道的神經(jīng)元由靜默轉為興奮，先出現一定數量的自發(fā)放電，然后出現相對幅度較小間期較長(cháng)的癲癇樣放電。癲癇樣放電的區域包括海馬（Cornu Ammonis，CA）部分區域和齒狀回（Dentate Gyrus，DG）部分區域，神經(jīng)元放電幅值在20～120μV（圖2b-2）。記錄10min后換回正常ACSF洗脫，癲癇樣放電隨之逐漸減弱30min后完全消失。

3.討論

現在神經(jīng)科學(xué)研究的主要目標就是研究功能性的神經(jīng)回路在生理和病理情況下的區別，而單個(gè)神經(jīng)元是構成神經(jīng)回路的基礎。神經(jīng)元的自發(fā)電活動(dòng)是大腦神經(jīng)回路編碼機制和信息處理機制研究的基礎，產(chǎn)生這些自發(fā)電活動(dòng)的生理信號是分布在大腦空間的，并且往往按照某些規則分布在大腦的。神經(jīng)系統疾病的發(fā)生發(fā)展往往表現為自發(fā)電活動(dòng)等生理信號的異常，在神經(jīng)系統疾病發(fā)生的時(shí)候往往不是一個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)電活動(dòng)發(fā)生了變化，而是很多甚至整個(gè)核團的自發(fā)電活動(dòng)和規律發(fā)生了變化，比如說(shuō)抑郁、癲癇、帕金森、阿爾茨海默等疾病。所以同時(shí)對自發(fā)電活動(dòng)的空間分布的多通道記錄是很重要的。

目前對于神經(jīng)元電活動(dòng)的研究方法主要有細胞內和細胞外玻璃電極記錄，微電極陣列技術(shù)，光遺傳學(xué)等。細胞內和細胞外玻璃電極記錄是目前最常用的，但只能記錄單細胞的放電，不適于研究多個(gè)神經(jīng)元的電活動(dòng)，而且它對于細胞來(lái)是有創(chuàng )的，只能用于短時(shí)間記錄。光遺傳學(xué)主要應用對電壓或鈣敏感的染料來(lái)觀(guān)察細胞的活動(dòng)，只能看很淺層的神經(jīng)元（由于入射光只能穿透很淺的一層組織），還有性噪比的問(wèn)題，這些都限制了它的應用。另外還有比如功能性核磁共振、腦電圖、腦皮層電圖，但這些方法空間分辨率不夠，看不到單個(gè)神經(jīng)元電活動(dòng)的變化。要揭示神經(jīng)系統處理信息的復雜機制，必須獲得足夠數目的神經(jīng)細胞的電活動(dòng)信息。近些年隨著(zhù)電子技術(shù)和微機械加工技術(shù)的快速發(fā)展，微電極陣列技術(shù)也隨之得到了巨大提升。目前該技術(shù)可以同時(shí)檢測幾十甚至上百個(gè)通道的電信號，實(shí)現了對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的高空間分辨率檢測。因此，MED64平面微電極陣列系統對研究神經(jīng)組織網(wǎng)絡(luò )特性有著(zhù)很大的技術(shù)優(yōu)勢。

微電極陣列技術(shù)近年來(lái)多用于培養神經(jīng)元及神經(jīng)組織的電生理記錄。急性腦片的記錄也多為記錄興奮性突觸后場(chǎng)電位（Field Excitatory Postsynaptic Potential，fEPSP）。急性腦片自發(fā)放電記錄少有報道。本實(shí)驗使用平面微電極陣列技術(shù)記錄到成年小鼠海馬腦片神經(jīng)元自發(fā)放電并且成功建立4-AP+低鎂高鉀ACSF誘導的急性小鼠海馬腦片癲癇模型。通過(guò)實(shí)驗完善優(yōu)化了MED64系統記錄離體腦片自發(fā)放電的方法，拓展了該設備功能。為記錄分析活體組織神經(jīng)元自發(fā)性放電活動(dòng)的研究提供相應的技術(shù)保障。為學(xué)校研究癲癇、帕金森、抑郁、阿爾茨海默病等重大腦疾病提供科學(xué)研究平臺。