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石墨烯因其獨特的電學(xué)特性,是碳基生物傳感器(如微電極和場(chǎng)效應晶體管)的有前景的候選材料。最近,石墨烯生物傳感器已成功用于電生細胞的細胞外動(dòng)作電位記錄;然而,由于缺乏有效的細胞穿孔方法,細胞內記錄仍超出其當前能力范圍。在此,我們展示了一種由垂直生長(cháng)的三維模糊石墨烯(3DFG)構成的微電極平臺,能夠以高信噪比記錄細胞內的心臟動(dòng)作電位。我們利用超快脈沖激光產(chǎn)生的熱載流子來(lái)穿孔細胞膜,并在3DFG電極與細胞內域之間建立緊密接觸。這種方法使我們能夠檢測藥物對人源心肌細胞動(dòng)作電位形狀的影響。結合激光穿孔的3DFG電極可用于全碳細胞內微電極陣列,以監測細胞的電生理狀態(tài)。
一、介紹
監測神經(jīng)元和心肌細胞的電活動(dòng)對于研究大腦和心臟的電生理學(xué)、探究神經(jīng)退行性疾病或心臟疾病以及開(kāi)發(fā)新的治療策略具有根本的重要性。微電極陣列(MEA)平臺因其能夠通過(guò)同時(shí)測量數百/數千個(gè)細胞的電信號來(lái)監測大量細胞群而被廣泛使用。特別是在體外應用中,由于最近采用了新型二維(2D)和三維金屬電極配置,MEA方法在準確性與高通量之間提供了理想的平衡,這使得能夠記錄類(lèi)似細胞內動(dòng)作電位(AP)的信號。
石墨烯的非凡特性,如生物相容性、高電導率和柔韌性,使其成為開(kāi)發(fā)用于研究可興奮細胞電生理學(xué)的微電極陣列和晶體管的絕佳候選材料。然而,迄今為止,基于石墨烯的設備僅限于細胞外場(chǎng)電位(FP)記錄,這無(wú)法像膜片鉗技術(shù)那樣捕捉到動(dòng)作電位的主要特征。這極大地限制了石墨烯微電極在體外電生理學(xué)中的應用,因為準確監測細胞內動(dòng)作電位的能力是毒理學(xué)研究和藥物篩選試驗的一項基本要求。
利用納米材料(如多孔鉑)在水中通過(guò)光能產(chǎn)生高能載流子(熱載流子)已被證明能夠以非常局部且非侵入性的方式穿孔細胞膜。在石墨烯基材料中,光照射已被證實(shí)能夠產(chǎn)生熱載流子。因此,激光刺激基于石墨烯的微電極陣列可能會(huì )導致局部細胞膜穿孔(光穿孔),從而實(shí)現細胞內記錄。此外,增加石墨烯基電極的可用表面積有望在激光照射時(shí)產(chǎn)生更高程度的熱載流子,從而降低穿孔細胞所需的激光強度。我們近期報道了一種高比表面積的石墨烯基納米結構:三維毛狀石墨烯(3DFG)。3DFG的形態(tài)使其成為實(shí)現可興奮細胞光穿孔以進(jìn)行細胞內電活動(dòng)記錄的理想候選材料。
在此,我們展示了利用3DFG多電極陣列(MEA)通過(guò)光穿孔進(jìn)行心肌細胞動(dòng)作電位(AP)的細胞內記錄。在近紅外(NIR)波段用超快脈沖激光照射時(shí),3DFG電極中產(chǎn)生的熱載流子使細胞膜得以光穿孔。光穿孔與3DFG的高有效表面積相結合,能夠以高信噪比(SNR)記錄動(dòng)作電位,從而能夠識別各種藥物對心肌細胞離子電流的影響。通過(guò)心肌細胞-3DFG電極界面的橫截面掃描電子顯微鏡(SEM)成像觀(guān)察到,石墨烯薄片的垂直形態(tài)進(jìn)一步導致細胞質(zhì)膜與3DFG電極緊密貼合。這項工作將推動(dòng)開(kāi)發(fā)出柔韌、低成本且生物相容的全碳MEA平臺,用于細胞內電活動(dòng)記錄。此外,在近紅外二區(1000至1700納米)中石墨烯的低功函數可能使細胞穿孔在較厚的組織和類(lèi)器官中的應用成為可能,因為它們在近紅外二區的吸收和散射較少。
二、結果與討論
01.掃描電子顯微鏡、光學(xué)和光電特性表征
通過(guò)等離子體增強化學(xué)氣相沉積(PECVD)按照先前報道的程序合成了3DFG。通過(guò)調整合成參數,例如合成時(shí)間,我們可以定制出平面外石墨烯薄片的尺寸和密度。按照標準的微納加工工藝制造了功能性3DFG微電極陣列(MEA)(圖S1;有關(guān)3DFG制造的詳細信息,請參閱材料與方法)。在MEA制造過(guò)程中,3DFG的平面外形態(tài)得以保留,從而形成了高表面積的微電極(圖1A和圖S2;有關(guān)3DFG MEA的結構和電化學(xué)特性的詳細信息,請參閱注釋S1和S2)。
圖1三維多孔金柵(3DFG)的掃描電子顯微鏡(SEM)成像和光學(xué)特性表征。(A)5微米3DFG電極的SEM圖像。比例尺:5微米(I)、1微米(II)和0.5微米(III)。(B)熔融石英(灰色)、在800°C下合成10分鐘的3DFG(紅色)和在800°C下合成30分鐘的3DFG(藍色)的紫外-可見(jiàn)光吸收率隨波長(cháng)的變化。(C)3DFG在可見(jiàn)光和近紅外范圍內的介電常數的實(shí)部(ε1)和虛部(ε2)。(D)在1064納米超快(皮秒)脈沖激光激發(fā)下,3DFG電極與磷酸鹽緩沖液(PBS)界面產(chǎn)生的光電流,激光強度變化時(shí)的情況。脈沖序列持續時(shí)間為6毫秒。(E)激光激發(fā)產(chǎn)生的光電流的電容分量和法拉第分量。電容值取激光激發(fā)開(kāi)始時(shí)的最大電流峰值。法拉第值計算為激光脈沖序列結束前最后1毫秒部分的平均值。
增加垂直于平面的石墨烯薄片的尺寸和密度會(huì )導致紫外-可見(jiàn)光(UV-Vis)吸收率上升,這從獲取的UV-Vis光譜(圖1B)中可以看出。增強的吸收可歸因于垂直于平面的石墨烯薄片對光的捕獲能力增強,因為這種結構類(lèi)似于納米紋理硅和碳超材料。為了研究3DFG的光學(xué)響應類(lèi)型,我們對在800°C下合成90分鐘的3DFG薄膜進(jìn)行了表征,薄膜沉積在熔融石英基板上,通過(guò)橢圓偏振光譜法提取了材料在可見(jiàn)光和近紅外范圍內的介電常數(介電常數)的實(shí)部和虛部(圖1C)。介電常數提供了入射光子與材料相互作用類(lèi)型的信息。特別是,如果材料具有負實(shí)介電常數,并且與具有正實(shí)介電常數的材料(例如空氣或水)相接,入射光子可以通過(guò)激發(fā)表面等離子體激元與之強烈相互作用。我們對3DFG介電常數的測量表明,在300至1700納米范圍內,3DFG并未表現出等離子體行為,其介電常數(ε1)為正值,如圖1C所示。