03.使用3DFG MEA進(jìn)行細胞外和細胞內記錄

我們按照先前報道的協(xié)議將誘導多能干細胞來(lái)源的心肌細胞（hiPSC-CMs）培養在3DFG MEA上。培養至少3天后，誘導多能干細胞來(lái)源的心肌細胞（hiPSC-CMs）獲得自發(fā)且規律的電活動(dòng)和機械收縮。3DFG MEA能夠檢測到2D心臟培養物的自發(fā)動(dòng)作電位，信噪比約為27分貝。細胞外動(dòng)作電位呈現出典型的負相和預期的Q相（Na+峰值）短于30毫秒。培養物的自發(fā)跳動(dòng)頻率約為每分鐘60次，這與誘導多能干細胞來(lái)源的心肌細胞（hiPSC-CMs）的預期相符。正如先前的研究中所觀(guān)察到的那樣，在生理條件下，即在沒(méi)有用于穿孔細胞膜的任何外部刺激的情況下，使用3DFG電極進(jìn)行的細胞內動(dòng)作電位記錄不會(huì )發(fā)生。這表明盡管細胞與材料之間形成了緊密的黏附，但3DFG并不會(huì )自發(fā)地被心肌細胞內化。

圖3電生理記錄。（A）使用50微米電極的3DFG-MEA對誘導多能干細胞來(lái)源的心肌細胞（hiPSC-CMs）進(jìn)行的代表性體外場(chǎng)電位（FP）記錄。（B）激光照射后在50微米電極的3DFG-MEA上進(jìn)行的代表性細胞內動(dòng)作電位（AP）記錄。（C）激光照射后細胞膜修復以及體外場(chǎng)電位信號重新出現時(shí)細胞內耦合的時(shí)間穩定性。右側顯示，用激光第二次刺激心肌細胞，產(chǎn)生新的孔隙并恢復細胞內AP記錄。

用1064納米超快脈沖激光以約1毫瓦的功率進(jìn)行刺激，獲得了細胞內AP，表明3DFG在激光脈沖照射下成功實(shí)現了細胞膜的光穿孔。激光刺激后獲得的信號顯示單相正峰，平均持續時(shí)間為206±28毫秒（以562個(gè)AP的50%振幅計算）。所獲取的信號呈現出預期的心臟動(dòng)作電位成分，即初始的急劇去極化階段、輕微的復極化隨后是較長(cháng)的平臺期以及最終的復極化階段。細胞膜光穿孔可能歸因于在超快脈沖激光照射期間，3DFG電極發(fā)射出熱載流子。正如先前的研究中所報道的那樣，這些熱載流子處于熱力學(xué)非平衡狀態(tài)，能量很高，能夠在與3DFG的界面處形成電子等離子體。如果局部熱載流子密度超過(guò)某一閾值，電子等離子體的弛豫及其與水分子的碰撞會(huì )導致產(chǎn)生空化納米氣泡，從而局部破壞細胞膜。熱電子與水分子的碰撞使其平均自由程限制在電解質(zhì)-材料界面附近的幾十納米內。因此，光穿孔事件極其局限于激光激發(fā)的小區域（聚焦光斑直徑約為2微米）。由于大部分光能都用于發(fā)射電子，整個(gè)過(guò)程不會(huì )影響局部溫度（不產(chǎn)生熱量）。

我們對分布在三個(gè)不同的人誘導多能干細胞心肌細胞培養物中的六個(gè)3DFG多電極陣列進(jìn)行了細胞穿孔電生理實(shí)驗（包括下一節中的實(shí)驗）。3DFG實(shí)現局部光穿孔的成功率高達90%，與使用其他材料獲得的先前結果一致。在3DFG多電極陣列上獲取的細胞內動(dòng)作電位幅度從幾百微伏到5至6毫伏不等（平均細胞內動(dòng)作電位約為3.56±1.96毫伏），信噪比高達43分貝。在我們的實(shí)驗中，穿孔后可獲得的最大幅度受到采集系統規格的限制。幅度高于6毫伏的細胞內動(dòng)作電位有可能被記錄下來(lái)，但放大器的飽和會(huì )失真這些信號，因此被丟棄。

平均而言，5微米的3DFG超微電極比50微米的微電極能獲取到幅度更高的動(dòng)作電位。這可歸因于電極尺寸較小，導致光穿孔后密封電阻更高。為了突出3DFG-MEAs多通道細胞內記錄的優(yōu)勢，我們在圖S6中報告了一個(gè)在同一MEA上多個(gè)3DFG電極同時(shí)進(jìn)行細胞內記錄的示例。我們通過(guò)將MEA設備置于激光束下移動(dòng)，并隨后在同一樣本上對多個(gè)電極進(jìn)行光穿孔來(lái)獲得這些測量值。由于所有光穿孔事件可在幾秒內完成，而細胞內信號穩定幾分鐘，因此我們有充足的時(shí)間窗口，可同時(shí)從多個(gè)3DFG電極記錄細胞內動(dòng)作電位。對于心肌細胞，這些多點(diǎn)測量有助于繪制合胞體中信號傳播的模式和速度，并通過(guò)增加分析細胞的數量來(lái)提高數據的可靠性。圖S6還提供了所獲取細胞內信號變化性的見(jiàn)解。我們可以觀(guān)察到，信號的幅度因光穿孔后細胞內耦合程度的不同而有所差異。然而，各細胞中信號的形狀及其持續時(shí)間仍保持相對穩定，其變化處于商業(yè)hiPSC-CM系列中典型的心臟類(lèi)型變異性范圍內。

與使用其他微電極材料時(shí)觀(guān)察到的情況一樣，在3DFG上的光穿孔過(guò)程是非侵入性的，因為可以在同一細胞上重復多次。在圖3C所示的例子中，在首次光穿孔事件后幾分鐘內記錄到的細胞內動(dòng)作電位（AP）幅度約為1.5 mV。隨著(zhù)細胞膜的修復，信號幅度降低，細胞外場(chǎng)電位（FP）的形狀再次變得明顯。此時(shí)，我們在靠近首次激發(fā)的位置（距離首次激發(fā)幾微米）再次激發(fā)細胞，以使完全細胞內動(dòng)作電位的形狀立即恢復。第二次穿孔后的信號幅度更高，達到約3 mV。然而，首次穿孔事件和第二次穿孔事件期間動(dòng)作電位（AP）的持續時(shí)間并無(wú)差異。此外，在首次和第二次穿孔事件期間，培養物的跳動(dòng)頻率也保持不變。平均而言，多次光穿孔事件后記錄的動(dòng)作電位幅度更高，這是由于相對于總細胞-電極粘附面積，細胞內耦合面積增加所致。從長(cháng)遠來(lái)看，通過(guò)延長(cháng)單次光穿孔事件后3DFG的細胞內耦合，也可能實(shí)現更長(cháng)序列的細胞內動(dòng)作電位記錄。為實(shí)現這一目標，未來(lái)3DFG MEA的配置中可以采用文獻中的各種策略。用作3DFG生長(cháng)模板的突出納米結構可通過(guò)促進(jìn)細胞吞噬作用和誘導細胞膜彎曲來(lái)促進(jìn)細胞內耦合，而細胞膜彎曲反過(guò)來(lái)又能激活局部?jì)韧套饔玫鞍椎哪技?。為了更好地評估3DFG結合光穿孔技術(shù)的細胞內記錄性能，我們在表S1中報告了我們技術(shù)的主要特點(diǎn)以及其他在心肌細胞上測試的方法的特點(diǎn)。