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實(shí)驗步驟
采樣
除非另有說(shuō)明，漿果是在2007年6月和7月、2010年和2011年從美國馬薩諸塞州法爾茅斯的Little Sippewissett鹽沼形成的單個(gè)潮間帶池中采樣的（北緯41°34′33.01′，西經(jīng)70°38′21.24′））。2012年9月從Little Sippewissett(41°34'33.52'N,70°38'9.71'W)的第二個(gè)水池中采集了用于銀線(xiàn)硫化物捕獲和循環(huán)微伏安法的大漿果（直徑約0.5-1厘米）.粉紅色漿果也取自美國馬薩諸塞州伍茲霍爾的彭贊斯角沼澤(41°31′29.95′N(xiāo),70°41′7.48′W)，并于2011年夏季采集。漿果是從沉積物中收集的——通過(guò)篩分（1 mm網(wǎng)孔大?。┤コ缑?，并在0.2μM過(guò)濾除菌的沼澤水中洗滌3次。
SSU rRNA克隆文庫和桑格毛細管測序
將5到10個(gè)小聚集體用PCR級水均質(zhì)化，并使用MoBio PowerSoil試劑盒（MoBio，Carlsbad，CA，USA）提取DNA，采用1分鐘的珠擊步驟代替10分鐘的渦旋步驟進(jìn)行裂解制造商的協(xié)議中概述。如所述，細菌16S rRNA基因和真核18S rRNA基因在97%序列相似性閾值下進(jìn)行PCR擴增、克隆、測序和聚類(lèi)到操作分類(lèi)單元(OTU)支持信息S1中。去重復、嵌合體檢查的16S rRNA基因序列數據的GenBank登錄號是KF512914–KF513148，18S rRNA基因序列數據是KF516997–KF517018。系統發(fā)生樹(shù)是使用RAxML 7.2.8(Stamatakis,構建的，2006)具有1000個(gè)快速引導推斷和GTRGAMMA速率近似，或使用近似最大似然方法(Price等人，2010)的FastTree構建，具有1000個(gè)類(lèi)似SH的支持，GTRCAT 20個(gè)速率類(lèi)別的近似值。
宏基因組測序和分析
宏基因組測序
如所述，通過(guò)Roche GS 454 FLX+、Illumina HiSeq和Illumina MiSeq技術(shù)對提取的總群落DNA進(jìn)行測序支持信息S1中。所有質(zhì)量過(guò)濾、未組裝的序列數據均可在NCBI BioProject PRJNA214436的序列讀取存檔(SRA)登錄號SRX332170、SRX332174和SRX332175中獲得。數據也可通過(guò)MG-RAST服務(wù)器在MG-RAST ID 4454153.3、4517592.3和4516362.3下獲得。在可能的情況下，使用MG-RAST 3.3管道組裝重疊的Illumina MiSeq雙端讀數（250 bp），并使用M5RNA數據庫進(jìn)行分類(lèi)，以提供與16S rRNA基因克隆文庫平行的多樣性描述（Meyer等人，2008年）。為了評估多樣性，dsrAB硫循環(huán)標記基因的從策劃的構建了隱馬爾可夫模型（HMM）和全長(cháng)參考樹(shù)dsrAB比對（Loy等人，，2009年2009年使用HMMER 3.0和FastTree（Price））等人。,2010)由Phylosift管道實(shí)現(Darling et al.,2014)。使用Phylosift管道，使用LAST（Kielbasa掃描Illumina序列讀數，使用等人，2011年）HMMER 3.0與參考標記比對，并使用pplacer置于全長(cháng)dsrAB系統發(fā)育樹(shù)上（Matsen等人，2010年）.
宏基因組組裝、基因組分箱和基因組完整性
Roche 454 Titanium和交錯雙端Illumina HiSeq數據使用idba_ud算法1.0.9(Peng共同組裝et al.,2012)。使用來(lái)自蛋白質(zhì)查詢(xún)，Desulfobulbus propionicus和Allochromatium vinosum的在這個(gè)完整的、組裝的宏基因組數據的核苷酸數據庫上進(jìn)行了tBLASTn搜索，以確定關(guān)鍵的硫循環(huán)功能基因。該數據集已作為全基因組散彈槍(WGS)項目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，編號為AVFP00000000。本文描述的版本為AVFP01000000版本。數據也可通過(guò)MG-RAST ID 4532235.3下的MG-RAST數據庫獲得。
大于1 kb的重疊群使用描述的涌現自組織圖譜通過(guò)四核苷酸頻率合并到基因組中支持信息S1和之前（Dick等人，2009年；Wrighton等人，2012年）中。FigShare(提供了PB-PSB1和PB-SRB1基因組的RAST注釋http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.770903)。該基因組項目草案已作為WGS項目存放在DDBJ/EMBL/GenBank中，登記號為AVFQ00000000和AVFR00000000。本文中描述的版本是版本AVFQ01000000和AVFR01000000。
顯微鏡和nanoSIMS的嵌入和冷凍切片
洗凈的漿果在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中漂洗1分鐘，然后在室溫下固定1小時(shí)（4%多聚甲醛，0.5%戊二醛的PBS）。固定后，漿果用PBS洗滌3次，并在冷凍保護劑溶液（PBS中的7.5%蔗糖）中孵育>1小時(shí)。然后將漿果轉移到OCT TissueTek（Sakura，CA，USA）并在液氮中快速冷凍之前使其滲透2小時(shí)以上。使用直剃刀低溫恒溫器在-20°C下以10μm厚度切片冷凍組織塊。將用于CARD-FISH雜交和表面反射共聚焦顯微鏡的樣品置于Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides（Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上，而將用于nanoSIMS的樣品置于玻璃圓或氧化銦錫(ITO)涂層玻璃上正方形（Dekas和Orphan，2011年）。
CARD-FISH，成像元素硫包裹體和共聚焦顯微鏡
ARB軟件包的探針設計工具(Ludwig et al.,2004)用于為16S rRNA基因克隆文庫數據中發(fā)現的PB-SRB1系統型創(chuàng )建特定探針。使用BLAST、SILVA數據庫（第108版）、核糖體數據庫項目和NCBI數據庫，針對GenBank數據庫檢查了針對該序列簇的探針(SRB-PiBe213)的特異性，并且對于目標簇之外的序列沒(méi)有命中檢測到。SRB-PiBe213探針(5'-tcctcctcgcacaaccgc-3')作為偶聯(lián)物從Biomers(Ulm,Germany)訂購。檢查通用γproteobacterial探針GAM42a探針序列，發(fā)現其靶向PB-PSB1序列。
除了與定制的SRB-PiBe213探針、GAM42A（Manz等人，1992年）和Delta495a-c與競爭對手ac（Lücker等人，2007年年）、真細菌探針EUB338I-III（Amann）雜交之外等人，，1990；Daims等人，1999年）用作陽(yáng)性對照，無(wú)義探針NON338（Wallner等人，1993年）用作非特異性結合的對照。雜交和酪酰胺信號放大如前所述（Ishii等人，2004年）進(jìn)行，修改在中有詳細描述支持信息S1。使用配備彩色相機（AxioCam HRc，Carl Zeiss，Thornwood，NY，USA）的Zeiss Axio IMAGER MZ落射熒光顯微鏡進(jìn)行初始成像。使用帶有可調白光激光器的Leica TCS SP8X共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany）進(jìn)行SRB-PiBE213 CARD-FISH雜交的共聚焦顯微鏡檢查。
如前所述（Pasteris在組織切片上使用Olympus FV1000 LSM通過(guò)表面反射共聚焦顯微鏡對紫色硫細菌細胞中的元素硫包裹體進(jìn)行成像等，，2001）。簡(jiǎn)而言之，488 nm激光線(xiàn)用于從具有478-498 nm檢測窗口的可折射元素硫顆粒產(chǎn)生反射信號，而使用543 nm激光線(xiàn)和自動(dòng)過(guò)濾器收集來(lái)自紫硫細菌細胞的自發(fā)熒光Alexa546熒光團的設置。
硫化物消耗測定
在的N在50毫升血清瓶中的缺氧過(guò)濾器滅菌的原位沼澤水中建立了三份微觀(guān)世界，每個(gè)小漿果（直徑約1-3毫米）2/CO 2含或不含硫化物頂空(90:10)下，添加至終濃度為1 mM。還建立了含有和不含1 mM硫化物的三次非生物對照，并且僅含有經(jīng)缺氧過(guò)濾消毒的原位沼澤水。微觀(guān)世界在28°C下以14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)培養，并通過(guò)分光光度法監測可溶性硫化物（Cline，1969年）。
循環(huán)微伏安法
使用手動(dòng)顯微操作器以0.1–1 mm的增量垂直降低玻璃Au-Hg汞齊電極（尖端繪制到約500μm直徑）對收集在50 ml Falcon管中的漿果進(jìn)行伏安分析。根據Brendel和Luther(概述的方法構建和校準電極1995)。在實(shí)驗室中校準電極的O 2、HS-和Mn 2+使用從樣品點(diǎn)收集的水；每個(gè)電極的響應在使用前立即通過(guò)測量200μM Mn的信號進(jìn)行檢查，2+并在Meites(之后使用先導離子方法進(jìn)行校準1965)和Slowey和Marvin-DiPasquale(2012)。電極的尖端被定位成使用這種技術(shù)穿透許多漿果。漿果通常在電極尖端能夠穿透之前稍微壓縮，然后漿果本身隨著(zhù)電極的穿透而移動(dòng)。因此，不可能進(jìn)行精確的空間參考，盡管很明顯在單個(gè)漿果內部確實(shí)發(fā)生了多次掃描。使用DLK-60恒電位儀和軟件（Analytical Instrument Systems,Flemington,NJ,USA）在每個(gè)位置獲得10個(gè)循環(huán)伏安圖序列。測量之間的儀器變異通常小于1%。還根據制造商的說(shuō)明使用Unisense硫化物微傳感器（Unisense，Aarhus，Denmark）獨立測量其他聚集體中的硫化物，假設內部pH值為8（Seitz計算總硫化物等，1993）。
δ硫化物捕獲和SIMS 7f-Geo離子微探針?lè )治?4 S的
收集大漿果（直徑0.5-1厘米），沖洗干凈，穿入24號銀絲（99.95%；美國新澤西州弗洛勒姆公園的Surepure Chemetals），并孵育在原位下午4點(diǎn)至第二天上午11點(diǎn).然后取出漿果，用去離子水沖洗電線(xiàn)并在分析前儲存在氮氣氛下。將導線(xiàn)切片，使用雙面碳帶安裝在玻璃圓上，并濺射涂有10納米的金。在加州理工學(xué)院微量分析中心使用Cameca IMS 7f-GEO磁扇形SIMS使用先前描述的方法（例如Fike和Grotzinger，2008年；Fike等人，2008年；Fike等人，2009)并在中有詳細說(shuō)明支持信息S1。
穩定同位素修正實(shí)驗
缺氧、過(guò)濾滅菌的原位沼澤水用修正，13 C富集碳酸氫鹽（98原子％13 C，Isotec Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國）最終濃度為10 mM，和34 S富集硫酸鹽（90原子%34 S，Isotec Sigma-Aldrich），最終濃度為28 mM，在水中天然存在的濃度之上（硫酸鹽最初測量為26.5 mM）。將漿果洗去沉淀物并放入血清瓶中孵育，其中硫化物添加到0.5 mM和N 2/CO 2(90:10)頂空。在黑暗或光照（14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗循環(huán)）下，在28°C下培養4天。在10 mM鉬酸鈉存在下也建立了類(lèi)似的光/暗孵育，以抑制聚集體中硫酸鹽還原細菌的活性。同位素未標記的光和暗對照溫育平行溫育，并且由在沼澤水中天然存在的物質(zhì)的頂部等量添加標準同位素組成碳酸氫鹽和硫酸鹽組成。
4天后，將漿果從孵化中取出，固定、包埋并切片用于nanoSIMS分析。來(lái)自光照條件的漿果被切片到玻璃圓片上，隨后濺射鍍上10納米的金。將連續的暗培養切片在導電ITO方塊上（Dekas和Orphan，2011年）。來(lái)自三個(gè)黑暗生物復制品（+/-鉬酸鹽和未標記的對照）的幾個(gè)漿果被固定并快速冷凍，無(wú)需嵌入，以便通過(guò)散裝元素分析儀同位素比質(zhì)譜（EA-IRMS）進(jìn)行分析。
NanoSIMS樣品制備和成像
使用相差和落射熒光顯微鏡對用于nanoSIMS分析的樣品進(jìn)行光學(xué)映射，以識別PB-PSB1靶細胞的島。未對這些樣品進(jìn)行FISH和CARD-FISH以保存細胞內元素硫內含物，發(fā)現這些內含物在這些協(xié)議所需的透化步驟中會(huì )被洗掉。在nanoSIMS分析之前，發(fā)現目標PB-PSB1細胞具有豐富的細胞內硫包裹體。
2010年和2011年，在加州理工學(xué)院微量分析中心的Cameca NanoSIMS 50 L儀器上進(jìn)行了兩次單獨的為期3天的測量。使用初級Cs+離子束在1.2 pA下收集樣品，對應于約50 nm的標稱(chēng)光斑尺寸.光束以256×256或512×512像素分辨率在15至30μm大小的方形區域上進(jìn)行光柵化。所有樣品都預先濺射10-15分鐘以局部去除任何外層或金涂層。同時(shí)收集七個(gè)次級離子，12 C-、13 C-、12 C 14 N-、12 C 15 N-、31 P-、32 S-、34 S-。NanoSIMS圖像使用“打開(kāi)MIMS”，一個(gè)插件的ImageJ可在線(xiàn)處理http://www.nrims.hms.harvard.edu/NRIMS_ImageJ.php（Gormanns等人。，2012）。每個(gè)系列的幀都針對漂移和檢測器死區時(shí)間進(jìn)行了校正，但代表了未針對儀器質(zhì)量分餾進(jìn)行校正的原始值。顯示的值是來(lái)自每個(gè)分析區域的幾個(gè)幀的總和。
通過(guò)EA-IRMS批量分析硫同位素
原位沼澤水中的硫酸鹽用氯化鋇沉淀（Kolmert等人，2000年），干燥并準備用于EA-IRMS。從三次孵化保存的粉紅色漿果（深色，+/-同位素標記，+/-10 mM鉬酸鈉）在55°C下干燥48小時(shí)，并在密封的鋁箔中卷曲。使用ECS 4010元素分析儀（Costech Analytical Technologies,Valencia,CA,USA）與Thermo Finnigan Delta V Plus質(zhì)譜儀（Thermo Scientific,Waltham,MA,USA）聯(lián)用分析樣品的硫同位素組成。硫同位素組成根據NBS-127、IAEA-S1和IAEA-S3進(jìn)行校準。相對于V-CDT(Vienna Canyon Diablo Troilite)標度，硫同位素值以每密耳(‰)為單位報告。根據幾天內的重復分析，這些硫同位素測量值的重現性<0.3‰(1σ)。
碳固定的放射性碳測定
將五個(gè)無(wú)沉積物的2毫米直徑漿果的孵化放置在帶有1毫升過(guò)濾消毒的原位沼澤水和N小型螺旋蓋管中2/CO 2頂部空間(90:10)的。在環(huán)境光、暗或最終濃度為10 mM的鉬酸鈉中，將重復孵育預平衡3小時(shí)。還用熱滅活的漿果（煮沸10分鐘）制備了重復的小瓶。就在實(shí)驗開(kāi)始之前，每次孵育都用中和的硫化物修正至終濃度為1 mM，然后加入10μL 14 C碳酸氫鹽的0.01 M氫氧化鈉溶液，標稱(chēng)比活為250μCi/ml.在由196個(gè)紅外發(fā)光二極管（λ=850 nm）陣列照明的室溫下，孵育1或4小時(shí)后取樣，以確保任何觀(guān)察到的碳固定來(lái)自紫硫細菌，而不是來(lái)自含氧光養生物（硅藻、藍藻）)在漿果中。
通過(guò)添加1 ml飽和尿素溶液并加熱至85°C 30分鐘以滅活和分解漿果來(lái)終止孵育。通過(guò)在玻璃閃爍瓶中將50μL漿果勻漿與400μL冰醋酸在65°C下加熱20分鐘，去除未摻入的放射性碳酸氫鹽。在整個(gè)加熱過(guò)程中輕輕敲擊小瓶以確保去除邊緣附近的任何冷凝物。將10毫升Universol閃爍混合物添加到樣品中，并使用LS 650多用途閃爍計數器（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）將生物質(zhì)中的酸穩定產(chǎn)物量化為每秒閃爍次數。
致謝
我們要感謝多年來(lái)在海洋生物實(shí)驗室微生物多樣性課程中為這項研究做出貢獻的許多學(xué)生、教員和講師的出色工作；我們特別感謝Cristina Moraru和Rebekah J.Ward在開(kāi)發(fā)嵌入和CARD-FISH協(xié)議方面提供的幫助、Jarrod J.Scott提供2007年的16S rRNA基因序列數據以及Alexander P.Petroff的有益討論。非常感謝Douglas C.Nelson和Susan E.Alford在放射性碳固定分析方面的工作，Abigail Green-Saxena和Yunbin Guan協(xié)助nanoSIMS數據采集，Fotios C.Kafantaris進(jìn)行微伏安測量工作，Jennifer Houghton Julie Huber使用感謝她的實(shí)驗室和Claire Beaudoin進(jìn)行硫化物微傳感器測量，感謝Nanelle R.Barash和Annette R.Rowe對手稿的批判性閱讀。這項工作得到了NSF贈款DEB-1310168、EAR-1124389和EAR-1123391、戈登和貝蒂摩爾基金會(huì )(#3306)的贈款以及來(lái)自美國加州大學(xué)戴維斯分校研究生研究獎學(xué)金的Elizabeth G.Wilbanks的支持論文年獎學(xué)金、PEO學(xué)者獎和NAI/APS天體生物學(xué)劉易斯和克拉克基金。這項研究由MBL微生物多樣性課程的參與者進(jìn)行，并得到了霍華德休斯醫學(xué)基金會(huì )、戈登和貝蒂摩爾基金會(huì )(#2493)、美國國家科學(xué)基金會(huì )(DEB-0917499)、美國能源部(DE-FG02)的部分支持-10ER13361）和美國宇航局天體生物學(xué)研究所。
《鹽堿地沼澤中的光養粉紅色貝類(lèi)的微量硫循環(huán)》——概括 、介紹
《鹽堿地沼澤中的光養粉紅色貝類(lèi)的微量硫循環(huán)》——結果
