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2.材料和方法
2.1.實(shí)驗程序
沉積物取樣于中國珠江三角洲容桂鎮（22°450 N，113°150 E）的一條受工業(yè)和生活廢水污染的城市小溪。這條小溪氧氣有限，有一股特有的臭味。使用前，使用0.149-mm的篩子對沉積物進(jìn)行篩分、均質(zhì)，并在25°C的暗處儲存。批量試驗采用以下程序：首先，在40ml棕色小瓶中構建90個(gè)微觀(guān)世界，其中含有25g原始沉積物（含水量~60%，氧化還原電位（ORP）~-200mV）和5ml消毒水。其次，將純水（作為對照）和五劑SPC溶液（Alfa Aesar，中國）注入微宇宙，使微宇宙中的SPC含量增加到5.6、11.2、16.8、22.4和33.6 mmol SPC g-1濕沉積物。最后，用聚四氟乙烯蓋密封小瓶，立即搖動(dòng)以實(shí)現均質(zhì)，并在25°C的黑暗中靜態(tài)儲存。所有治療均一式三份進(jìn)行。在添加SPC后3小時(shí)（稱(chēng)為第0天）、15天、37天和50天，對五個(gè)處理組和對照組的每18個(gè)樣本進(jìn)行分析。
在每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，搖動(dòng)18個(gè)微觀(guān)世界以實(shí)現均勻化。首先，用微電極測定pH和ORP（丹麥Unisense）。然后，提取三份0.5 g沉積物并儲存在?80°C下：一份用于測試第2.2節所述的本地微生物群落的潛在代謝活性；第二部分用于提取16S rRNA基因，以進(jìn)行第2.3節所述的高通量測序；第三份用于測定酸揮發(fā)性硫化物（AVS，數據如圖S1所示）。以3000 rpm離心殘余沉積物15分鐘，并通過(guò)0.45-mm膜過(guò)濾上清液以獲得沉積物的液相。這用于測定溶解物質(zhì)，包括硫酸鹽、硝酸鹽、銨、磷酸鹽、無(wú)機碳（碳酸鹽）和溶解有機碳（DOC）。使用離子色譜儀（Thermo-DIONEX，ICS-11OO（KOH用作流動(dòng)相）和ICS-900）測試無(wú)機鹽，使用TOC分析儀（Elementar Vario TOC，德國）測試DOC。
2.2.本地微生物群落潛在代謝活性的測定
如前所述，本地微生物群落的潛在代謝活性由Biolog生態(tài)板（Biolog，美國）確定（Gu等人，2014年）。簡(jiǎn)言之，將0.5 g濕沉積物和4.5 mL 0.9%NaCl（pH?7.0）超聲處理八次（每次15秒）（KQ-300DE，柯橋），然后沉淀0.5 h以從沉積物中釋放細菌。之后，提取1 mL懸浮液并添加到新的離心管中，用0.9%的鹽水替換液體兩次，以去除溶解物質(zhì)。在600 nm處，將替換懸浮液的吸光度稀釋至0.05±0.01，以確保每個(gè)樣品包含大致相同的生物量濃度。最后，向ECO板的每個(gè)孔中加入150 mL稀釋溶液。ECO板在30°C的黑暗中孵育。在最初12小時(shí)后，然后每24小時(shí)（直到148小時(shí)）使用微孔板讀取器（Multiskan GO，Thermo）測量595 nm處的吸光度，以獲得ECO板所有31個(gè)碳源的平均井色顯影（AWCD）。
2.3.DNA提取、16S rRNA基因測序和分析
根據先前的研究進(jìn)行了DNA提取和純化（Fang等人，2015）。使用條形碼引物314F（50eCCT ACG GGN GGC WGC AG-30）和805R（50-GAC TAC HVG GGT ATC TAA TCC-30）擴增16S rRNA基因的V3tV4高變區（Vasileiadis等人，2012年）。使用Illumina Miseq PE300作為測序平臺，配對末端讀數與FLASH（v2.2.00）連接在一起（Magoc和Salzberg，2011）。在Mothur（v1.39.5）（Schloss等人，2009年）中進(jìn)行了質(zhì)量控制，包括去除低質(zhì)量讀取、嵌合序列和V3tV4區域的堿基。
隨后的分析在Louca（Louca et al.，2017）描述的QIIME（v1.9.0）（Caporaso et al.，2010）中進(jìn)行，并進(jìn)行了修改：根據97%的相似性閾值（Edgar，2010），對照SILVA數據庫（版本123），將高質(zhì)量序列聚類(lèi)到操作分類(lèi)單元（OTU）。這包括usearch的內置嵌合體檢查。分類(lèi)信息通過(guò)Uclust方法分配給每個(gè)OTU。在這些初步分析之后，獲得了由1339個(gè)OTU組成的OTU表，其中每個(gè)樣本的讀數介于12777和42044之間。OTU表被細化為每個(gè)樣本12777次讀數，以便后續分析。
2.4.數據分析
對于多重比較，在SPSS（v20.0）中進(jìn)行T檢驗（p<0.05*、p<0.01**和p<0.001***）和鄧肯檢驗的方差分析（a?0.05）。進(jìn)行了以下統計分析：（1）非度量多維標度（NMDS）、使用距離矩陣的排列多元方差分析（Adonis）、相似性分析（Anosim）和多反應排列程序（MRPP）。使用R studio（v3.3.2）確定微生物群落的總體變化；2）在QIIME中分析了微生物群落的α多樣性值；3）采用層次聚類(lèi)法比較微生物群落的分類(lèi)組成；4）此外，為了將微生物群落與一個(gè)或多個(gè)感興趣的代謝功能相關(guān)聯(lián)，如Louca等人（2016）所述，使用原核生物分類(lèi)群的功能注釋?zhuān)‵APROTAX）算法預測功能組；5）在R studio中，通過(guò)冗余分析（RDA）分析環(huán)境變量和微生物組成（被認為是屬）之間的關(guān)系；6）spearman秩相關(guān)分析在R studio中進(jìn)行，以調查（a）功能組和環(huán)境變量之間的關(guān)系，以及（b）功能組和所考慮的屬之間的關(guān)系。
環(huán)境變量和微生物群落對污染沉積物中添加過(guò)碳酸鈉的響應——摘要、介紹
環(huán)境變量和微生物群落對污染沉積物中添加過(guò)碳酸鈉的響應——材料和方法
