摘要

遠洋環(huán)境中的氧氣呼吸速率通常難以量化，因為我們的氧氣濃度測定方法的分辨率對于在小于24小時(shí)的瓶?jì)扰囵B過(guò)程中觀(guān)察到顯著(zhù)的降低是有限的。在這里，我們提出了一種新的高靈敏度方法的評估，該方法將可切換微量氧（STOX）傳感器與人工降低O2濃度的全玻璃瓶培養相結合。該方法的呼吸速率檢測限與O2濃度成反比，對于初始O2濃度為500 nmol L-1的水，檢測限降至<2 nmol L-1 h-1。該方法在丹麥沿海水域和海洋缺氧水域進(jìn)行了試驗。事實(shí)證明，它還可以在低耗氧率（~7 nmol L-1 h-1）下進(jìn)行精確測量，并顯著(zhù)減少培養所需的時(shí)間(≤14小時(shí)）與傳統方法相比。該方法提供連續實(shí)時(shí)測量，允許多種可能性，例如模擬氧氣減少速率以獲得動(dòng)力學(xué)參數。我們的數據顯示，海洋細菌的表觀(guān)半飽和濃度（Km值）比之前報道的低一個(gè)數量級，介于66和234 nmol L-1 O2之間。Km值在不同的浮游微生物群落中有所不同，但我們的數據表明，在0.5–1 mmol L-1 O2濃度下測量可靠的呼吸速率是可能的，與在完全空氣飽和時(shí)測量的呼吸速率相當。

介紹

氧是生命的一個(gè)關(guān)鍵參數，生物體的呼吸耗氧量作為多個(gè)變量的函數已被廣泛研究。然而，氧呼吸不僅在生理學(xué)方面很有趣，而且是碳的生物地球化學(xué)循環(huán)和通過(guò)任何生態(tài)系統的有機物質(zhì)流動(dòng)中的一個(gè)主要因素。雖然我們地球的大部分地區被海水覆蓋，但對浮游生物群落呼吸（CR）的直接測量卻相對較少。由于用于測定O2濃度的應用方法（例如Winkler滴定法或Clark型傳感器）的分辨率低且檢測限高（，1 mmol L-1），因此很難通過(guò)實(shí)驗室培養海水來(lái)直接測量氧氣消耗率[1]。因此，直接呼吸測量在很大程度上被限制在最活躍的上層海洋200 m處，導致數據庫在季節、緯度和深度方面存在很大偏差[2,3]。在中層和深海海水、貧營(yíng)養區和天然低氧水域（如氧氣最低區（OMZ））中發(fā)現的低速率的直接測量基本上是缺失的，我們通常依賴(lài)于估計值[4–6]。由于缺乏對海洋（150米以下）的微光區和暗區的測量，這兩個(gè)區域占海洋體積的98%，在光層多余有機物的礦化、儲存和埋藏中起著(zhù)關(guān)鍵作用[7]，影響了我們獲得可靠的海洋浮游呼吸總體估計值的能力，以及由此得出的全球碳預算[8]。根據從占海洋表面80%的非生產(chǎn)性水生系統[9]獲得的有爭議的結果，尚未解決的討論仍在繼續。據估計，這些地區的呼吸速率大大超過(guò)初級生產(chǎn)力，表明當地凈異養[10–12]。另一方面，通過(guò)不同類(lèi)型的數據分析，發(fā)現公海的有機碳收支基本上與有機碳平衡[13]。

同樣，缺乏氧氣最低區水域有氧呼吸過(guò)程的詳細數據限制了我們對其建立和發(fā)展的理解和預測能力[14]。此外，為了通過(guò)直接測量耗氧量來(lái)評估CR率，通常采用較長(cháng)的孵育時(shí)間（$24小時(shí)），因為這是不可避免的，因為呼吸率低，技術(shù)靈敏度低。然而，長(cháng)時(shí)間的孵化可能會(huì )導致群落結構和動(dòng)態(tài)的變化，導致對比率的不切實(shí)際的估計[15,16]。因此，需要更可靠、更準確的測量方法，以及常規評估低放射性水域鉻含量的新方法。

最近，通過(guò)使用改進(jìn)版的電子傳輸系統（ETS）酶法測定微型浮游生物呼吸速率[17]，報告了呼吸速率的較低檢測限[18]。在相對較短的時(shí)間內（在寡養水體中為3至5.5小時(shí)），通過(guò)還原2-對（碘苯基）-3（硝基苯基）-5（苯基）氯化四氮唑（INT），在體內估計ETS的活性。該方法的分析檢出限為64 nmol L-1不溶性福爾馬贊晶體（INT-F）。該值相當于80 nmol L-1 O2，使用電子傳遞系統（R/ETS比率）測量的呼吸速率和酶活性之間的比率（12.8）將ETS活性轉化為碳呼吸。因此，通過(guò)測量真實(shí)的原位生理速率而不是體外潛在呼吸，該方法應超越標準ETS測定的限制。盡管其檢測限有所提高，但這類(lèi)酶法用于呼吸測量的有效性和準確性受到了嚴重質(zhì)疑[6]。

近年來(lái)，開(kāi)發(fā)了用于高精度測量氧濃度的新型傳感器。因此，高分辨率STOX傳感器和高靈敏度光學(xué)傳感器（optodes）是研究水生呼吸的合適且有希望的工具[19][20]。

為了克服與之前在低活性和低氧水域中的呼吸測量相關(guān)的技術(shù)和方法問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)并驗證了一種以低速率直接定量CR的程序。這是使用高分辨率STOX傳感器[19]在人為降低的O2濃度下完成的，并假設在低和高O2濃度下的速率是可比較的。需要較低的O2濃度才能達到該方法的最高靈敏度。然而，上述比較無(wú)法在低活性海洋水域進(jìn)行測試，因為在高氧濃度下的吸氧動(dòng)力學(xué)無(wú)法用任何標準方法可靠解析。因此，我們首先在高活性沿海水域進(jìn)行了一項比較研究，其中氧消耗率由STOX法和標準溫克勒滴定法測定。此后，我們使用STOX方法評估來(lái)自熱帶北太平洋東部（ETNP）OMZ的海水中的CR率。此外，我們還介紹了各種浮游生物群落從完全有氧條件到幾乎零氧條件下的耗氧動(dòng)力學(xué)；探索一個(gè)新的，描述不清的，有氧呼吸仍在發(fā)生的濃度范圍。

材料和方法

道德聲明

本研究中使用的三個(gè)丹麥地點(diǎn)的水的獲取和取樣無(wú)需特別許可。在“Thomas G.Thompson”號客輪的東熱帶北太平洋（ETNP）巡航（2012年3月至4月）期間，在墨西哥水域航行、取樣和工作，需獲得墨西哥政府的許可。對于所有站點(diǎn)和所有實(shí)驗，均未涉及瀕?；蚴鼙Ｗo物種。

圖1。培養瓶。培養用玻璃瓶，容積為1160 mL（注入紅色墨水以增加對比度）。A）用于插入STOX傳感器的開(kāi)口（內徑8.1 mm）；B）用于壓力補償的長(cháng)開(kāi)口玻璃管（內徑2.5 mm）（管內注入藍色墨水以增加對比度）；C）玻璃涂層磁鐵（2.5厘米），用于持續攪拌。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g001

研究地點(diǎn)和抽樣

從丹麥的三個(gè)不同地點(diǎn)采集海水和微咸水樣本（圖S1）。在三個(gè)季節（2011年6月至7月、2011年9月和2013年1月至2月）對兩個(gè)主要地點(diǎn)（圣城1號和圣城2號）進(jìn)行了采樣，額外的圣城3號僅在2013年2月進(jìn)行采樣，如下所述。1號站位于Randers峽灣（56u31912.2299N；10u13948.5999E），受其內部?jì)蓷l河流的淡水排放和高有機負荷的影響[21]。采樣期間（2011年6月、9月和2013年1月），采樣點(diǎn)的鹽度范圍為7%至9%。2號站位于奧胡斯Marselisborg Marina附近的卡特加特（56u08914.3299N；10u12955.1999E）。采樣點(diǎn)非?？拷０毒€(xiàn)，采樣期間（2011年7月、9月和2013年1月）鹽度在16%到26%之間。2013年2月取樣的3號站位于丹麥北海海岸（57u0791299N；08u3791299E）漢斯霍姆港，鹽度為35%。收集表層海水，通過(guò)250mm篩網(wǎng)過(guò)濾以去除較大的動(dòng)物群，并在采樣后3小時(shí)內將其裝在干凈的聚乙烯容器中運輸至實(shí)驗室。

在R/V Thompson（2012年3月和4月）上的ENTP春季巡航期間，該方法也被用作在東熱帶北太平洋（ETNP）氧氣最低區（4號站，16u29993.2599N，109u59900.5999W）的船上試驗。4號站距離墨西哥海岸約700公里（圖S1）。海水樣品用10 L Niskin瓶花環(huán)采集于110 m處，剛好低于氧氣層。在該深度，通過(guò)使用STOX傳感器的高分辨率原位氧氣分析，發(fā)現無(wú)法檢測到溶解氧[22]。取樣后不久進(jìn)行瓶培養，如下所示。

設置和實(shí)驗

實(shí)驗室培養實(shí)驗在1160 mL的定制改良Schott Duran玻璃瓶中進(jìn)行（圖1）。一根25厘米長(cháng)的玻璃管（內徑0.25厘米）穿過(guò)瓶子一側的玻璃壁。它用于壓力補償，以便溫度-體積變化不會(huì )導致氣泡形成和其他不良影響。一根更寬的玻璃管（內徑0.8厘米）取代了原來(lái)的瓶頸，用于插入STOX氧傳感器。瓶子內容物僅在毛細管頂部的水-空氣界面處與空氣接觸（圖1b），但由于該毛細管的內徑較小，氧氣進(jìn)入瓶子的傳輸可忽略不計（見(jiàn)結果部分）。STOX傳感器的直徑在8 mm瓶頸的0.1 mm范圍內，因此與空氣的接觸僅限于0.3 cm距離內的超薄水層（圖1 a）。由于STOX傳感器和8毫米頸部之間的強毛細管作用，任何體積變化將僅在壓力補償管中可見(jiàn)。

圖2。對照實(shí)驗的結果（實(shí)驗1）。顯示了具有不同氧濃度的四個(gè)不同重復。添加64 h 1 mL空氣，飽和0.05 M HCl，在毫質(zhì)量水中，對應于244 nmol L-1 O2，用于傳感器校準。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g002

在實(shí)驗過(guò)程中，瓶子被置于黑暗中，浸泡在恒溫（15uC和21uC）的水浴中。使用2.5 cm長(cháng)的玻璃涂層磁鐵（Fisher Scientific）（圖1 C）進(jìn)行連續攪拌，同時(shí)將裝有瓶子的容器置于磁攪拌器（IKA）頂部。

為了在測量氧氣濃度時(shí)獲得最高的相對分辨率，使用STOX傳感器時(shí)，必須在低氧氣濃度下工作。因此，通過(guò)使用混合有0.05%CO2的N2鼓泡來(lái)降低待研究水的O2濃度。

由于灌裝過(guò)程中的空氣污染，很難在瓶中獲得非常低的O2濃度，但以下程序可使初始濃度降至約100 nmol-1。將待調查的水與N2混合0.05%CO2鼓泡約15分鐘，同時(shí)將其封閉在一個(gè)10或20升的玻璃瓶中，該玻璃瓶只有一個(gè)小開(kāi)口，以允許氣體逸出。然后，使用帶有泰貢管接頭的玻璃管虹吸管從儲液罐中注滿(mǎn)瓶子，同時(shí)仍在冒泡。泰貢是首選，因為它相對不透氧且透明，因此可以觀(guān)察到不需要的氣泡的存在。通過(guò)壓力補償管進(jìn)行填充，同時(shí)通過(guò)插入8mm頸部的5mm泰貢管將惰性氣體流保持在瓶子內。在保持氣流和水流入的同時(shí)，將瓶子倒置，丟棄流入瓶子的前50-100毫升水；之后，瓶子被完全填滿(mǎn)。然后立即插入STOX傳感器，同時(shí)中斷通過(guò)虹吸管的水流。

所有試驗均在取樣后30小時(shí)內進(jìn)行，培養最長(cháng)持續時(shí)間為20小時(shí)。所有玻璃器皿先在0.1 M NaOH中清洗，然后在0.1 M HCl中清洗，以避免有機污染。

對STOX方法進(jìn)行了測試（實(shí)驗1），并與丹麥沿海和峽灣水域的標準Winkler技術(shù)進(jìn)行了比較（實(shí)驗2）；隨后，將STOX方法應用于海洋水域，以評估ETNP OMZ中間深度的CR率（見(jiàn)表3）。

實(shí)驗1-測試方法。氧內流和傳感器穩定性的控制實(shí)驗。在實(shí)驗1中，上述設置用于評估方法的準確性和分辨率，以及檢查外部和內部O2污染的可能來(lái)源。因此，用生物非活性水建立了一個(gè)對照實(shí)驗，其中在4個(gè)重復瓶中監測O2濃度，該瓶中裝有0.05 M HCl和軟化水，軟化水經(jīng)過(guò)煮沸、冷卻，然后用N2氣體脫氣至低O2水平（圖2）。

實(shí)驗2-方法在沿海水域的應用和比較。在實(shí)驗2中，使用相同的設置和程序，在三個(gè)不同季節用STOX法測量了St.1、2和3的浮游生物群落呼吸率。為St.1、2和3設置一組平行培養瓶（n=3），以比較用STOX法（在低氧濃度下）獲得的CR率與用Winkler滴定法在空氣飽和時(shí)測得的呼吸率。此外，浮游生物群落的動(dòng)力學(xué)參數由STOX方法獲得的數據建模。對于空氣飽和條件下的培養，重復上述相同的程序，但在這種情況下，用水輕輕地鼓入空氣，并用實(shí)心玻璃棒更換STOX傳感器以關(guān)閉瓶子。在孵育24小時(shí)之前和之后，通過(guò)Winkler滴定法在12 mL Exetainers（n=6）中采集氧氣測定樣品。按照Labasque等人[23]描述的程序，通過(guò)分光光度法測定O2濃度。

實(shí)驗3-海洋水域中的方法應用。在實(shí)驗3中，用STOX方法測量了太平洋St.4海洋樣本的浮游生物群落呼吸速率（圖S1）。

葉綠素a提取

對于每個(gè)站點(diǎn)，在開(kāi)始瓶培養之前，通過(guò)Advantec GF-75玻璃纖維過(guò)濾器過(guò)濾1L海水，然后用96%乙醇提取色素，從取樣水中提取葉綠素a[24]。測量分四次進(jìn)行，葉綠素a濃度根據Lorenzen方法計算[25]。

傳感器：原理、校準和電子學(xué)

STOX傳感器是一種安培式氧傳感器，具有就地零點(diǎn)校準的內置功能。該傳感器由內部氧微傳感器[26]組成，內部氧微傳感器位于外部微傳感器外殼內，外部微傳感器外殼配有額外的硅膜。在兩個(gè)膜之間，放置一個(gè)由多孔金制成的外陰極（前防護罩）。該前防護罩在20.8 V電壓下的極化消耗了從外部介質(zhì)擴散到測量傳感器的所有氧氣，導致現場(chǎng)零電流測定。隨后前防護罩的去極化允許氧氣通過(guò)并到達測量陰極。測得的電流差與氧濃度成正比。由于每個(gè)測量循環(huán)都記錄了新的零點(diǎn)讀數，因此該信號與零點(diǎn)漂移無(wú)關(guān)，并允許定義零O2濃度。零點(diǎn)測定的高精度允許非常高的低O2濃度分辨率，而在接近空氣飽和的濃度下首選其他方法。與標準氧氣微傳感器相比，STOX傳感器具有較高的攪拌靈敏度，且整個(gè)循環(huán)的響應時(shí)間相對較長(cháng)（20秒至幾分鐘），因此，它們最適合在氧氣濃度變化相對緩慢的攪拌介質(zhì)中進(jìn)行分析，如本文所述的瓶?jì)扰囵B。微傳感器是按照前面的描述制造的[19,27]。在每次實(shí)驗期間，通過(guò)向瓶子中注入已知體積的空氣飽和水，對每個(gè)傳感器進(jìn)行校準。傳感器連接到PA8000八通道皮安計（Unisense a/S，丹麥），而前防護的極化和去極化由定制的定時(shí)器控制開(kāi)關(guān)箱調節，前防護的開(kāi)啟和關(guān)閉周期定時(shí)器設置為250秒。信號由Unisense ADC816 16位a/D轉換器采集，該轉換器使用Sensortrace Basic程序連接至便攜式PC（Unisense a/S，丹麥）（圖S2）。

圖3。與沿海海水孵育的STOX傳感器中氧氣消耗的時(shí)間過(guò)程。來(lái)自站點(diǎn)2水孵化的STOX傳感器數據示例（Marselisborg Marina，2011年9月）。僅繪制每個(gè)循環(huán)期間的最小和最大讀數，并用線(xiàn)連接。最大和最小讀數之間的差值用作O2濃度的測量值。信號的初始振幅（11 pA）對應于200 nmol-1瓶中的O2濃度。如紅線(xiàn)所示，在1h（2ml，600nmol-1）和6.7h（4ml，1200nmol-1）注射空氣飽和水。內政部：10.1371/期刊。波內。0105399.g003

動(dòng)力學(xué)參數的數據分析與建模

在每組培養中連續記錄氧氣濃度，最長(cháng)持續20小時(shí)。氧氣消耗率通過(guò)氧氣濃度隨時(shí)間的線(xiàn)性回歸計算得出。利用STOX方法獲得的數據，通過(guò)離散O2間隔上的運行斜率計算斜率。對于高于6 mmol L-1的O2濃度，使用2 mmol L-1間隔，并且隨著(zhù)O2的減少，逐漸降低濃度范圍。線(xiàn)性模型的擬合通過(guò)確定系數r2進(jìn)行評估。

Michaelis-Menten方程的動(dòng)力學(xué)參數Vmax（最大呼吸速率）和Km（表觀(guān)半飽和常數）：

通過(guò)直接對每個(gè)復制的進(jìn)度曲線(xiàn)（濃度與時(shí)間）進(jìn)行非線(xiàn)性參數擬合來(lái)估計。數據符合方程（2），該方程描述了氧隨時(shí)間的逐漸吸收[28]：

式中，C（t）是氧濃度隨時(shí)間的函數，Co是所考慮間隔的初始濃度。Vmax和Km迭代變化，直到使用Excel中的解算器命令實(shí)現通過(guò)最小二乘法調整獲得的最佳擬合[29]。

為了測試動(dòng)力學(xué)參數是否隨時(shí)間變化，在同一個(gè)瓶子中和幾個(gè)實(shí)驗中，通過(guò)在氧氣濃度接近零時(shí)注入空氣飽和水，測定了兩次Km和Vmax值。

為了在模型和實(shí)驗數據之間獲得更好的擬合，我們還測試了一個(gè)經(jīng)驗關(guān)系，該關(guān)系最初是為光合作用的光飽和曲線(xiàn)而建立的[30]。Jassby和Platt方法表示呼吸速率與氧濃度的關(guān)系如下：

其中a是低氧水平下曲線(xiàn)的初始斜率。為了使用半飽和常數（Km），對方程進(jìn)行了修改，采用以下關(guān)系式，表示符合Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)的速率-濃度曲線(xiàn)的初始斜率：

結合方程式3和4：

與使用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)類(lèi)似，培養過(guò)程中氧濃度的時(shí)間演變符合以下方程式：

遵循與上述相同的迭代過(guò)程。