3.3 CHT對反硝化酶、基因豐度和微生物群落結構的影響

為了確定CHT對反硝化酶活性的影響，評估了四種反硝化還原酶（NAR、NIR、NOR和NOS）的活性（Saggar等人，2013）。如圖3a和b所示，對照處理和CHT處理在NAR活性方面沒(méi)有顯著(zhù)差異。對照組的NIR活性顯著(zhù)高于C25處理組（P＜0.01）。這與NO2的變化是一致的?在本研究中，這表明CHT顯著(zhù)抑制NO2?還原過(guò)程，產(chǎn)生NO2?高濃度CHT的累積。與對照組相比，C25處理組的NOR活性顯著(zhù)降低29.4%（P＜0.05），而C5和C10處理組的NOR活性無(wú)顯著(zhù)差異。此外，高CHT添加處理（C10、C25）的NOS活性也顯著(zhù)降低（P b 0.01），C25處理的NOS活性比對照（C0）下降80.3%。從結果來(lái)看，NOS活性的下降大于NOR活性的下降，這表明C25處理中NOS活性的顯著(zhù)抑制可能導致CHT施用后N2O排放量增加。鄭等人（2014b）還發(fā)現，大量N2O排放與相應的反硝化還原酶活性抑制有關(guān)。如上所述，CHT對NIR、NOR和NOS活性的顯著(zhù)抑制可能是CHT對反硝化過(guò)程產(chǎn)生負面影響的原因。

圖3.百菌清（CHT）對反硝化過(guò)程中NAR（a）、NIR（b）、NOR（c）和NOS（d）活性的影響。數據顯示為三次獨立測量的平均±標準偏差。Tukey t檢驗，與對照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

作為反硝化基因表達的產(chǎn)物，反硝化還原酶活性與反硝化基因豐度相關(guān)。由于CHT對反硝化的抑制是一個(gè)劑量反應過(guò)程，因此NO3存在顯著(zhù)差異?C0和C25處理之間的減少和N2O排放。因此，本研究選擇CHT對C0和C25處理下反硝化基因豐度的影響進(jìn)行研究。如圖S3所示，功能基因narG、nirS、nirK、norB和nosZ的拷貝數在104到107拷貝之間?1干燥土壤。對照組或CHT處理中narG基因的拷貝數高于其他四個(gè)基因的拷貝數。這一結果與之前的研究一致，之前的研究報告表明，narG基因在大多數自然土壤中的豐度最高（李等，2017；張等，2016）。對照處理的nirS、nirK和norB基因豐度分別為5.06×104、4.20×104和4.65×104?1干土。與之前研究中報告的基因豐度相比（Henry等人，2006），本研究中的nirS、nirK和norB基因豐度明顯較低。這可能與實(shí)驗土壤中反硝化細菌豐度的差異有關(guān)。值得注意的是，本研究中的nirS基因拷貝數低于nirK基因拷貝數，這與之前的研究不一致（Shrewsbury等人，2016）。nirS和nirK基因之間豐度的差異可能取決于土壤性質(zhì)，如pH值、養分和土壤銅（Cu）含量（Enwall等人，2010）。我們的結果表明，本研究中的茶園土壤比nirS基因更適合nirK基因，并且可以促進(jìn)nirK基因豐度的增加。此外，thenosZ基因的拷貝數（約105個(gè)拷貝）為?1干土）與之前研究（Henry等人，2006）中測量的其他自然土壤相似，比nirK、nirS和norB基因的拷貝數大一個(gè)數量級。

圖4顯示，CHT添加降低了反硝化菌中的基因豐度，但程度不同。方差分析顯示，對照組之間的差異不顯著(zhù)（1.81×107μg）?1干土）和C25處理（1.76×107 g?1干土）的narG基因數據。然而，與對照處理相比，CHT處理的nirK、nirS和norB基因豐度分別下降了31.6%、22.1%和12.7%。CHT處理中nirK（P b 0.05）和nirS（P b 0.05）基因豐度的顯著(zhù)降低可能導致反硝化菌中NIR活性的降低，這可能是NO2累積的另一個(gè)原因?.C25處理的nosZ基因拷貝數為2.47×105拷貝?1干土，與對照處理（5.01×105拷貝）相比減少了50.7%?1干土）（P b 0.01）。nosZ基因豐度的降低可能導致NOS活性的降低，這將顯著(zhù)抑制從N2O到N2的減少。nosZ基因豐度的降低（50.7%）遠高于norB基因豐度的降低（12.7%），這表明CHT對N2O消耗的抑制作用比N2O產(chǎn)生的抑制作用強得多，導致N2O排放量顯著(zhù)增加。

圖4.百菌清（CHT）對對照組和25 mg kg體重組narG、nirS、nirK、norB和nosZ的相對基因豐度的影響?1 CHT處理。Tukey t檢驗，與對照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

從對照和CHT處理中獲得的細菌在門(mén)和類(lèi)群水平上的分類(lèi)學(xué)如圖S4所示。厚壁菌、放線(xiàn)菌、氯屈曲菌和變形菌在兩種處理中占優(yōu)勢。與對照處理相比，CHT處理后厚壁菌和放線(xiàn)菌的相對豐度分別從81.6%和9.4%下降到80.9%和5.2%。在類(lèi)別水平上，在C0和C25處理中均檢測到α、β、γ和δ-變形菌，在之前的研究中，據報告這些變形菌與氮循環(huán)過(guò)程有關(guān)（王等人，2016）。從C0到C25處理，α、β和δ變形菌的豐度分別下降了2.3%、0.04%和0.1%。兩種處理中檢測到的前25個(gè)屬如圖S5所示。芽孢桿菌作為自然系統中潛在反硝化的貢獻者和nosZ基因的持有者（Verbaendert等人，2011），在CHT處理后從9.8%下降到8%。如上所述，對照和C25處理之間的微生物群落沒(méi)有明顯變化。這表明CHT的應用可能不會(huì )通過(guò)改變微生物群落來(lái)影響反硝化過(guò)程，但可能會(huì )影響微生物的細胞內代謝。測定ETSA值和ATP含量以評估CHT對微生物代謝過(guò)程的影響。

3.4 CHT對反硝化相關(guān)代謝過(guò)程的影響

反硝化菌接受來(lái)自有機物代謝過(guò)程和電子傳輸鏈的電子，以完成反硝化過(guò)程（Chen和Strous，2013）。碳源代謝和電子傳遞過(guò)程與反硝化過(guò)程密切相關(guān)。因此，通過(guò)測量ETSA值和ATP含量來(lái)確定CHT對這兩個(gè)過(guò)程的影響。如圖5a所示，ETSA值為0.186μgO2·mg?1蛋白質(zhì)·min?C0為1，C5、C10和C25分別下降了34.9%、43.5%和46.7%，這表明較高的CHT應用可以大大降低ETSA值。對照組和低CHT濃度（C5）之間的ETSA值沒(méi)有顯著(zhù)差異。同時(shí)，高濃度CHT（C10（P b 0.05）、C25（P b 0.05））顯著(zhù)抑制電子傳遞系統。此前的一項研究還報告稱(chēng)，ETSA值的降低與反硝化過(guò)程的抑制有關(guān)（Wan等人，2016年）。C25處理中ETSA值最低的記錄表明CHT對電子傳輸過(guò)程有抑制作用，這將導致反硝化過(guò)程中可用的電子更少。

圖5.對照組和百菌清（CHT）處理（5、10和25 mg kg）中電子傳遞系統活性（ETSA）（a）、三磷酸腺苷（ATP）含量（b）的值?1）72小時(shí)后，誤差條表示三次試驗的標準偏差。Tukey t檢驗，與對照組相比，*P b 0.05，**P b 0.01。

圖5b表明，土壤中的ATP含量將隨著(zhù)CHT濃度的增加而降低。ATP濃度為8.86 nmol g?1，但顯著(zhù)下降至4.63和2.85 nmol g?分別在C10（P b 0.05）和C25（P b 0.01）處理中為1。ATP被廣泛認為是參與細胞內能量轉移的貨幣單位，可以在碳源代謝和電子傳遞鏈中產(chǎn)生（Knowles，1980）。Hammes等人（2010年）報告說(shuō)，ATP可能是微生物生存能力的有用指標。在本研究中，對照治療中的ATP濃度與之前研究中報告的相似（邱等人，2016）。對于C25處理，ATP濃度的降低可能表明CHT對微生物活性具有抑制作用，例如碳源代謝以及電子傳輸和消耗過(guò)程（Junge和Nelson，2015）。結合ETSA值和ATP含量的結果，CHT應用將抑制電子傳輸過(guò)程。因此，到脫氮過(guò)程的有限電子傳輸可能是CHT應用后抑制脫氮過(guò)程的一個(gè)因素。

3.5土壤反硝化作用與分子指標的關(guān)系

盡管3號?還原過(guò)程和相關(guān)還原酶活性已由之前的研究確定，我們對NO3之間關(guān)系的理解?去除過(guò)程和還原酶活性仍不清楚。因此，建立了線(xiàn)性關(guān)系，將反硝化過(guò)程與分子指標聯(lián)系起來(lái)，以便更好地在分子水平上理解反硝化過(guò)程。

通過(guò)相關(guān)分析建立了反硝化作用與分子指標之間的關(guān)系（表S3）。一些關(guān)鍵相關(guān)性如圖6所示。如圖6a所示，NO3?-氮去除率與NAR活性呈正相關(guān)，因為NAR可以減少NO3?至NO2?.最終NO2-N濃度與NAR和NIR活性呈負相關(guān)（圖6b），NIR和最終NO2的擬合線(xiàn)斜率?-氮濃度大于NAR和最終NO2的濃度?-氮濃度。這種關(guān)系表明CHT對NO2的抑制作用?還原過(guò)程大于NO2上的還原過(guò)程?導致NO2累積的生產(chǎn)過(guò)程?.同樣，最終N2O濃度與NOR和NOS活性呈負相關(guān)（圖6c）。根據相關(guān)分析數據（表S3），NOS的相關(guān)系數(?0.968）高于NOR(?0.920）與N2O濃度相關(guān)。這表明NOS活性對CHT比NOR活性更敏感。因此，NOS活性的降低是導致N2O積累的關(guān)鍵因素。至于微生物活性指標，圖6d和e表明，ATP含量與四種反硝化酶的活性呈正相關(guān)，表明反硝化過(guò)程的抑制可能是由于微生物代謝的下降。ETSA值與NOR和NOS活性顯著(zhù)正相關(guān)。這些結果表明，電子傳遞的減少可能是CHT對反硝化產(chǎn)生急性抑制作用的另一個(gè)原因。

圖6.反硝化酶活性與NO3之間的線(xiàn)性關(guān)系?-N去除率（a）；NO2號?-氮濃度（b）；N2O-N濃度（c）；三磷酸腺苷（ATP）含量（d）（e）；和電子傳輸系統活性（ETSA）值（f）。

3.6環(huán)境意義

近幾十年來(lái)，全球茶園面積顯著(zhù)增長(cháng)，從2002年（265萬(wàn)公頃）到2014年（437萬(wàn)公頃），增長(cháng)了64.9%。茶園區域的反硝化過(guò)程令人擔憂(yōu)，因為它會(huì )產(chǎn)生溫室氣體N2O。我們的結果表明，將CHT的施用量從0增加到25 mg kg?1抑制NO3?去除效率從83.8%提高到54.1%，但N2O排放量增加了94.8%。當533.4 kgN hm時(shí)?在茶園區域施用2%的氮肥和5 mg kg?大田施用CHT 1，年N2O-N排放量增加3.0×106kg，年未還原NO3量增加?-氮保持在5.48×108 kg。因此，CHT在茶園土壤上的應用將對全球氣候產(chǎn)生負面影響，導致更多的NO3?從土壤中滲入水中，導致富營(yíng)養化加劇。雖然施用CHT會(huì )增加茶園土壤反硝化過(guò)程中的N2O排放，但也應考慮通過(guò)CHT控制茶樹(shù)病害。今后，應嚴格限制農藥的施用量，以平衡害蟲(chóng)控制和環(huán)境風(fēng)險。

4、結論

在72小時(shí)的實(shí)驗室試驗中，研究了CHT對茶園土壤的急性影響。結果表明，CHT的應用導致了NO3的減少?去除效率、NO2積累?,以及N2O排放量的增加。CHT的施用抑制了反硝化酶的活性，降低了反硝化基因的豐度。此外，本研究表明，CHT應用導致ETSA和ATP含量降低。需要進(jìn)一步研究以確定CHT對土壤反硝化的慢性影響及其代謝產(chǎn)物對土壤健康的潛在毒性。

致謝

本研究得到了中央高?；A研究基金（編號：106112017CDJXY210005、106112017CDJQJ218843）的資助。我們還感謝弗雷德里克·庫隆教授和匿名評論員對本手稿的早期草稿提出的建設性建議和意見(jiàn)。