細胞培養基（cell culture medium）是人工模擬動(dòng)物細胞的體內生長(cháng)環(huán)境，維持體外細胞存活和增殖的營(yíng)養物質(zhì)基礎，其主要功能是為細胞提供適宜的pH和滲透壓，以及細胞本身不能合成的各種營(yíng)養物質(zhì)。本文將對細胞培養基的種類(lèi)、成分及理化性質(zhì)，以及相關(guān)問(wèn)題等方面進(jìn)行介紹。

1、細胞培養基的種類(lèi)

按照細胞培養基的發(fā)展歷史，細胞培養基大致可分為平衡鹽溶液、天然細胞培養基、合成細胞培養基、無(wú)血清細胞培養基、限定化學(xué)成分細胞培養基等幾大種類(lèi)。

1.1、平衡鹽溶液（balanced salt solution，BSS）

BSS主要是由無(wú)機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養。其主要用于細胞的漂洗、配制其他試劑等。幾種常用的BSS配方如下（表1-1）。

D-Hank's與Hank's的一個(gè)主要區別是前者不含有Ca2+和Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。因為Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成份，參與細胞粘附等功能，使用不含Ca2+、Mg2+的BSS可避免細胞結團。此外，Hanks液和Earle液是常用的BSS基礎溶液，前者緩沖能力較弱，適合于密閉培養；后者緩沖能力較強，適合于5%CO2的培養條件。

表1-1幾種常用的BSS配方（g/L）

1.2、天然細胞培養基

天然培養基指來(lái)自動(dòng)物體液或利用組織分離提取的一類(lèi)培養基，如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等。其優(yōu)點(diǎn)是營(yíng)養成分豐富，培養效果良好，但缺點(diǎn)是成分復雜，來(lái)源受限且制作過(guò)程復雜、批間差異大。目前廣泛使用的天然培養基是血清，另外各種組織提取液、促進(jìn)細胞貼壁的膠原類(lèi)物質(zhì)在培養某些特殊細胞也是*。

水解乳蛋白是乳白蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶水解的產(chǎn)物，含豐富的多肽、氨基酸和碳水化合物。一般配制成0.5%溶液（采用平衡鹽溶液溶解）與合成培養基（如MEM細胞培養基）以1:1的比例混合使用。

目前用于細胞培養的血清主要是牛血清，培養某些特殊細胞也用人血清、馬血清等。牛血清對絕大多數哺乳動(dòng)物細胞都是適合的，但并不排除在培養某種細胞時(shí)使用其他動(dòng)物血清更合適。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長(cháng)因子、激素、無(wú)機物等，這些物質(zhì)對促進(jìn)細胞生長(cháng)或抑制生長(cháng)活性是達到生理平衡的。此外，血清含一些對細胞產(chǎn)生毒性的物質(zhì)，如多胺氧化酶，能與來(lái)自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會(huì )影響細胞生長(cháng)，甚至造成細胞死亡。目前，血清多作為一種添加成分與合成培養基混合使用，使用濃度一般為5~20%，-常用是10%。

由于水解乳蛋白和血清成份復雜，批間差異大及存在病毒等外源污染風(fēng)險，對下游生物制品的分離純化和安全性都存在較大的影響，在生物制藥行業(yè)的使用也越來(lái)越少。因此，基于對血漿成份的分析，合成細胞培養基應運而生。

1.3、合成細胞培養基

合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設計、配制的培養基。早開(kāi)發(fā)的基礎培養基（minimal essential medium,MEM），其本質(zhì)為含有鹽、氨基酸、維生素和其他必需營(yíng)養物的pH緩沖的等滲混合物。在此基礎上，DMEM、IMDM、HAM F12、PRMI1640等各種合成細胞培養基被不斷開(kāi)發(fā)出來(lái)。常用合成培養基的配方此處不詳細介紹，其特性及應用的范圍見(jiàn)表1-2。

表1-2常用合成培養基的特性及應用的范圍

與天然培養基相比，有些天然的未知成分尚無(wú)法用已知的化學(xué)成分所替代，因此，細胞培養中使用合成培養基時(shí)必須加入一定量的天然培養基成分，以克服合成培養基的不足。-普遍的做法是添加5~10%的血清，這樣才能維持細胞活力，促進(jìn)細胞增殖。針對不同的動(dòng)物細胞，現已開(kāi)發(fā)了多種商業(yè)化、個(gè)性化的低血清細胞培養基配方，營(yíng)養成份更加豐富，血清使用量可降低至1～3%，由此可減少了血清等動(dòng)物來(lái)源成份對生物制品安全性的影響。

1.4、無(wú)血清細胞培養基（serum free medium，SFM）

經(jīng)歷了天然培養基、合成培養基后，無(wú)血清培養基和無(wú)血清培養成為當今細胞培養領(lǐng)域的一大趨勢。采用無(wú)血清培養可降低生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免病毒污染造成的危害。無(wú)血清培養基，一般是在合成培養基的基礎上，加入成份完全明確的或部分明確的血清替代成份，達到既能滿(mǎn)足動(dòng)物細胞培養的要求，又能有效克服使用血清所帶來(lái)問(wèn)題的目的。

無(wú)血清培養基中通常需要添加一些額外的組分，才能幫助細胞貼壁生長(cháng)，包括以下幾大類(lèi)物質(zhì)：

1）促貼壁物質(zhì)：一般為細胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著(zhù)重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2）促生長(cháng)因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長(cháng)因子。激素也是刺激細胞生長(cháng)、維持細胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細胞*的，如胰島素。

3）酶抑制劑：培養貼壁生長(cháng)的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養基中需含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。-常用的是大豆胰酶抑制劑。

4）結合蛋白和轉運蛋白：常見(jiàn)如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養的無(wú)血清培養基都含有牛血清白蛋白。

5）微量元素：硒是-常見(jiàn)的。

1.5、無(wú)蛋白無(wú)血清細胞培養基與化學(xué)組份限定無(wú)血清細胞培養基

1）無(wú)蛋白無(wú)血清細胞培養基（protein free midium,PFM）

這類(lèi)培養基完全不含有動(dòng)物來(lái)源蛋白，但仍有部份添加物是植物蛋白的小水解片段或合成多肽片段，以及類(lèi)固醇激素和脂類(lèi)前體等，以替代動(dòng)物激素、生長(cháng)因子的作用。其特點(diǎn)是完全沒(méi)有蛋白或蛋白含量極低，有利于生物制品的分離純化。

2）化學(xué)組份限定無(wú)血清細胞培養基（Chemically defined media,CDM）

此類(lèi)培養基是目前-安全、-為理想的無(wú)血清細胞培養基，所有成份的濃度都完全明確，即使其所添加的少量蛋白，也是可經(jīng)過(guò)純化處理，成份明確、濃度確定的蛋白。這類(lèi)培養基較為理想地減少了生產(chǎn)的可變性，提高了生產(chǎn)工藝的重復性，并有效降低了純化成本。

1.6、個(gè)性化細胞培養基

嚴格意義上來(lái)說(shuō)，個(gè)性化細胞培養基不在細胞培養基的傳統分類(lèi)之列，其具體是指一類(lèi)根據細胞特性、細胞培養工藝特點(diǎn)、使用者需求習慣而量身定制的細胞培養基，主要目的是提高細胞產(chǎn)率、產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品安全性和降低血清的使用等。個(gè)性化細胞培養基可能是無(wú)血清培養基，也可能是低血清培養基，終是為滿(mǎn)足某一種或某一類(lèi)生物制品的生產(chǎn)需求。

2、培養基的基本組分

細胞培養基必須含有充分的營(yíng)養物質(zhì)，才能滿(mǎn)足新細胞合成、細胞代謝等生化反應所需要的物質(zhì)和能量。細胞培養基的主要成份是水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機鹽和其它一些輔助營(yíng)養物質(zhì)等。此外，還可能含有血清、血清替代成分、pH指示劑等。

2.1、水

水是細胞的主要成份，也是細胞賴(lài)以生存的主要環(huán)境。細胞培養液中90%以上的成份是水。細胞對水的品質(zhì)非常敏感，水的品質(zhì)將直接影響細胞培養的效果。而水中通常含有重金屬、氯、磷、有機物、熱原等污染物，細胞培養用水須經(jīng)過(guò)純化，品質(zhì)應符合中國藥典注射用水標準或者超純水的標準。

2.2、能源和碳源

能源和碳源是用于維持細胞生命和支持細胞生長(cháng)，主要包括糖、糖酵解的產(chǎn)物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物質(zhì)。細胞能夠利用的糖類(lèi)主要是六碳糖，目前大多體外培養時(shí)選取葡萄糖作為細胞的主要碳源和能量來(lái)源，因此細胞培養基中基本都含有葡萄糖，含量一般為5～25 mmol/L。

在葡萄糖濃度較高時(shí)，細胞主要通過(guò)擴散作用吸收葡萄糖，細胞膜內外的葡萄糖濃度梯度是細胞吸收葡萄糖的動(dòng)力；在葡萄糖濃度較低時(shí)，主要由鈉離子推動(dòng)的高親和性轉運過(guò)程使細胞攝取葡萄糖。葡萄糖進(jìn)入細胞后參與糖酵解、核酸代謝、糖原合成、能量代謝以及一些氨基酸的合成。與體內的能量供應途徑不同，體外培養時(shí)，一定的濃度范圍條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解循環(huán)轉化成乳酸來(lái)為細胞提供能量。

2.3、氮源（氨基酸）

氨基酸在細胞內的重要生理作用主要體現在以下幾個(gè)方面：

①是蛋白質(zhì)的基本組成單位，用于合成蛋白質(zhì)和多肽；

②可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；

③某些氨基酸還具有獨特的生理作用，如甘氨酸參與生物轉化作用，丙氨酸和谷氨酰胺參與細胞內氨的運輸等；

④可轉變成糖類(lèi)和脂肪，參與氧化供能。

細胞所能利用的氨基酸是L型同分異構體，D型氨基酸不能被利用。不同的細胞對氨基酸的需求各異，但有些必需氨基酸是細胞不能自身合成的，必須依靠外源的細胞培養液提供。其余非必需氨基酸，細胞可以自己合成，或通過(guò)轉氨作用由其他物質(zhì)轉化而來(lái)，但是在細胞培養基中添加適當濃度的非必需氨基酸可以減輕細胞在合成方面的負擔，提高谷氨酰胺及其它必需氨基酸的利用率。

絕大部分細胞對谷氨酰胺有較高的要求，可能因其不僅是細胞的主要氮源，且可作為細胞生長(cháng)的能源物質(zhì)和嘌呤、嘧啶核苷酸的前體，另外還可直接作為細胞增殖和產(chǎn)物合成中的蛋白質(zhì)和多肽的組成成分。在缺少谷氨酰胺時(shí)，細胞會(huì )生長(cháng)不良，甚至死亡。由于谷氨酰胺具有多種生理作用，體外動(dòng)物細胞培養時(shí)需要大量谷氨酰胺，利用量常超過(guò)其他必須氨基酸利用量的總和。

2.4、維生素

維生素是維持細胞生長(cháng)的生物活性物質(zhì)，在細胞代謝中起調節及控制作用。維生素可分為水溶性和脂溶性?xún)深?lèi)，水溶性維生素主要包括泛酸、維生素B12、葉酸、煙酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黃素、維生素C、膽堿、肌醇等；脂溶性維生素主要包括維生素A、D、E、K等；有的培養液中還直接采用ATP和輔酶A；大部分培養基中還有生物素。

許多維生素參與構成各種酶的活性基團的成分，沒(méi)有它們，酶便沒(méi)有活性，代謝活動(dòng)將無(wú)法進(jìn)行。比如，泛酸可以在細胞內轉變成?；d體蛋白和輔酶（如輔酶A），參與糖類(lèi)、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)代謝中的催化反應；維生素B12則在細胞內參與葉酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的細胞培養基中維生素的濃度有較大差異。例如，DMEM培養基中維生素的含量約為MEM培養基的兩倍，其原因是一方面不同種類(lèi)維生素的作用不同，另一方面不同種類(lèi)的細胞對維生素的需求也可能有較大差異，相應細胞培養基的配方中維生素的含量也可能不同。

2.5、無(wú)機鹽

無(wú)機鹽是細胞維持生命活動(dòng)所不可缺少的營(yíng)養成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43—、SO42—、HCO3－等，主要作用為維持細胞培養液滲透壓平衡，參與細胞的代謝活動(dòng)。此外，通過(guò)提供鈉，K+和Ca2+，幫助細胞調節細胞膜功能。Na+是細胞外液中主要的陽(yáng)離子，對維持滲透壓的恒定有決定性的作用，還與Cl－共同參與生物電活動(dòng)、維持水平衡和酸堿平衡等。K+主要分布在細胞內液，對于激活某些酶是必需的，并在調節細胞內環(huán)境的酸堿平衡上也有極重要意義。Ca2+和Mg2+主要參與信號傳導、能量代謝、脂肪酸合成、核糖體穩定和蛋白質(zhì)合成等多種生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基質(zhì)所需陰離子，同時(shí)是細胞內電荷的調節者。磷對于細胞的生長(cháng)、代謝和調控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白質(zhì)是構成細胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存儲和利用的不可或缺的化合物。

上述離子對于細胞的作用各有不同，它們共同構成了細胞賴(lài)以生存的滲透壓、pH和電化學(xué)平衡的微環(huán)境，細胞對于某種元素的吸收利用會(huì )受到其它元素的干擾，例如培養基中過(guò)高的鈣離子濃度會(huì )使鎂和鋅的吸收利用受到干擾。因此，在保證培養基中上述離子濃度滿(mǎn)足要求以外，還需保證上述離子之間種類(lèi)和比例的平衡。

此外，微量元素如鐵、鈷、鎳、硒、dian、銅、鋅、錳、鉻、鉬、氟等對于細胞生長(cháng)代謝和產(chǎn)物合成都有促進(jìn)作用。微量元素在細胞內通常以與有機物結合的形式存在。其中鐵在細胞中參與氧的轉運；鈷是維生素B12的組成部分，參與葉酸的合成和脂肪酸的合成；鎳能夠激活脫氧核糖核酸酶、乙酰輔酶A合成酶等在細胞內具有重要功能的酶，還具有穩定核酸結構的功能；亞硒-酸鈉中的硒，作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的輔基，具有抗過(guò)氧化物能力，參與消除細胞內的脂肪酸過(guò)氧化物，提高細胞的生長(cháng)速率和活性。

2.6、其他添加成分

在低血清、無(wú)血清細胞培養基中，為滿(mǎn)足細胞生長(cháng)增殖需要，常常添加一些成份：蛋白質(zhì)、多肽、核苷、嘌呤、檸檬酸循環(huán)的中間產(chǎn)物、脂類(lèi)、及一些血清替代因子等。其中蛋白質(zhì)具有重要的作用，動(dòng)物細胞對許多物質(zhì)（難溶于水的離子或脂類(lèi)物質(zhì)）的攝取需要借助蛋白質(zhì)的傳遞作用，如白蛋白、傳遞蛋白、貼壁蛋白等能夠攜帶脂肪酸、激素、礦物質(zhì)等促進(jìn)細胞生長(cháng)。轉鐵蛋白是一種重要的傳遞蛋白，能夠結合鐵，促進(jìn)細胞對鐵離子的吸收，并具有解毒作用，其促生長(cháng)作用可能與其具有生長(cháng)因子的功能有關(guān)。胰島素可促進(jìn)細胞對葡萄糖和氨基酸的利用，商業(yè)化中一些生長(cháng)因子以重組蛋白形式添加到培養基中，主要用來(lái)刺激細胞增殖，并可促進(jìn)糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一種重要的刺激細胞生長(cháng)的化合物，是腦磷酸的合成前提。

另外，酚紅作為pH值的指示劑被加入到細胞培養基中。酚紅在產(chǎn)物純化過(guò)程中會(huì )造成干擾，并且具有一定的固醇類(lèi)激素樣作用，如雌激素樣作用。當用于哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞的培養，可能會(huì )發(fā)生一些固醇類(lèi)反應?，F在商業(yè)化細胞培養基中的酚紅含量可根據需求調整。因生物反應器具有pH在線(xiàn)檢測技術(shù)，生物反應器培養動(dòng)物細胞時(shí)，酚紅可完全去除。

2.7、保護劑

細胞保護劑是保護細胞免受滲透壓變化、剪切力、氧化及氣泡作用等引起的損傷的物質(zhì)。在使用生物反應器培養動(dòng)物細胞時(shí)，細胞易被機械攪拌和通氣鼓泡產(chǎn)生的流體剪切力和氣泡作用所傷害甚至破損死亡。為降低這種損傷，除優(yōu)化生物反應器結構和生產(chǎn)工藝外，可在細胞培養液中添加一些保護劑。其主要是通過(guò)改變細胞培養基物性或是對細胞具有保護作用的物質(zhì)，常用的種類(lèi)有血清、白蛋白、聚已二醇（PEG）、非離子性表面活性劑PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。

3、細胞培養基的理化性質(zhì)

動(dòng)物細胞在細胞培養基中不僅能存活，還要分裂增殖，合適的滲透壓、pH值等理化性質(zhì)是細胞培養基必須具備的前提條件。

3.1、pH

動(dòng)物細胞大多數需要輕微的堿性條件，適宜pH在7.2～7.4之間。細胞培養基的pH值通常需經(jīng)校正的pH計來(lái)測定。在細胞生長(cháng)過(guò)程中，隨細胞數量的增多和代謝活動(dòng)的加強，二氧化碳不斷被釋放，培養液變酸，pH值發(fā)生變化。酚紅是細胞培養基中-常用的pH指示劑，但依靠細胞培養基中的酚紅等pH指示劑進(jìn)行判斷，需要實(shí)驗員的經(jīng)驗積累，存在較大的主觀(guān)性。實(shí)際上，個(gè)性化細胞培養基或是無(wú)血清細胞培養基中酚紅含量較少或是不含酚紅，只能通過(guò)pH計或者pH電極進(jìn)行pH值的檢測，結果更為準確可靠。

3.2、緩沖能力

細胞培養基應具有一定的緩沖能力。細胞培養過(guò)程中造成細胞培養液pH波動(dòng)的主要物質(zhì)是細胞代謝產(chǎn)生的CO2。在封閉式培養過(guò)程中CO2與水結合產(chǎn)生碳酸，細胞培養液pH很快下降；打開(kāi)培養器具時(shí)CO2逸出則會(huì )引起pH升高。細胞培養基通常采用NaHCO3-CO2緩沖系統，按下列化學(xué)反應方程式調節細胞培養基的pH值：

H2O+CO2→H2CO3?H++HCO3－

NaHCO3?Na++HCO3－

此外，還有緩沖能力較高的磷酸鹽緩沖系統。但碳酸鹽緩沖系統的細胞毒性小、成本低，在細胞培養中應用得更為廣泛。另一種較為常用的緩沖液是HEPES（羥乙基哌-嗪乙硫磺酸）液，它是一種非離子兩性緩沖液，在pH 7.0~7.2范圍內具有較好的緩沖能力。高濃度的HEPES可能對細胞有毒性作用，細胞培養時(shí)HEPES的添加濃度一般為10～25 mmol/L。

3.3、滲透壓

細胞必須生活在等滲的環(huán)境中，大多數體外培養的細胞對滲透壓有一定耐受性。研究顯示，對于大多數哺乳類(lèi)動(dòng)物細胞，滲透壓在260～320 mOsm/kg的范圍內都適宜。在生產(chǎn)、配制細胞培養基的過(guò)程中，滲透壓的測定較為重要，有助于防止在生產(chǎn)、配制過(guò)程中出現稱(chēng)量等方面的錯誤。反應器高密度培養動(dòng)物細胞過(guò)程，在添加碳酸氫鈉的過(guò)程中注意滲透壓的監控，防止滲透壓過(guò)高對細胞的損害。

3.4、溫度

溫度對細胞培養基有較大的影響，溫度過(guò)高可引起營(yíng)養成份的降解或破壞，細胞培養基的pH、離子強度和電解常數pKa也可能受到影響。如細胞培養液中的谷氨酰胺，在高溫條件下降解的速度較快，如35℃貯存時(shí)，放置3天降解25%左右，在4℃貯存3周降解約20%。

3.5、粘滯性及表面張力

含血清細胞培養液的粘滯性主要是由血清引起的，在轉瓶培養貼壁細胞時(shí)，培養液的粘滯性對細胞生長(cháng)沒(méi)有多大影響；但在生物反應器懸浮培養細胞時(shí)，細胞培養液的粘滯性則直接影響攪拌轉速控制及攪拌剪切力對細胞造成的損傷程度。

表面張力對細胞培養有較大的作用，尤其在利用生物反應器進(jìn)行懸浮培養時(shí)，攪拌和通氣都會(huì )引起泡沫的產(chǎn)生。對于含血清培養液，由于血清中多種蛋白的存在，攪拌時(shí)產(chǎn)生的氣泡較多，氣泡的上升運動(dòng)對細胞的損傷程度還有爭議，但氣泡的破裂對細胞有明顯的損傷作用。為降低這種損傷，可通過(guò)在細胞培養基中添加一些保護劑，降低細胞-氣體和細胞-液體的表面張力，減少氣泡的形成。

4、細胞培養基的滅菌及儲存

4.1、不同細胞培養基的除菌方式及注意事項

細胞培養基滅菌的方式分為高壓滅菌和膜過(guò)濾除菌，不同的培養基由于其營(yíng)養成份不同，滅菌方式也可能不同。

①高壓滅菌

某些培養基（如MEM）可進(jìn)行高壓滅菌，這類(lèi)培養基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，一般是在培養基高壓滅菌后才加入。另外可用耐高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺?？筛邏簻缇呐囵B基在121℃、15 psi，15分鐘的條件下完全可達到滅菌效果及營(yíng)養成分的小損失，不需將滅菌時(shí)間延長(cháng)。

絕大多數細胞培養基不適宜高壓滅菌。因培養液中常含有維生素、蛋白質(zhì)、多肽、生長(cháng)因子等物質(zhì)，這些物質(zhì)在高溫或射線(xiàn)照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用過(guò)濾消毒以除去細菌?？晒┻^(guò)濾滅菌使用的濾膜很多，其材料多為polyethersulphone（PES）、尼龍、多聚碳酸鹽、醋酸纖維素、硝酸纖維素、PTFE、陶瓷等。膜過(guò)濾除菌是當前較為常用及便捷的一種方法，常采用0.2μm孔徑的濾膜，部份采用0.1μm孔徑。與高壓過(guò)濾方式相比，濾膜具有使用期限且價(jià)格較高，但對細胞培養基的營(yíng)養成份破壞性較小。

4.2、不同細胞培養基存儲過(guò)程中的注意事項

通常液體細胞培養基避免-20℃凍存，因為解凍時(shí)可能會(huì )有營(yíng)養成份析出，影響培養效果。正常情況下于2~8℃避光保存，使用前從冰箱取出，放入室溫進(jìn)行平衡。通常的液體培養基有效期是6個(gè)月到12個(gè)月。液體細胞培養基盡量避免長(cháng)期貯存，其中的谷氨酰胺會(huì )隨著(zhù)儲存時(shí)間的延長(cháng)而慢慢分解，如果細胞生長(cháng)不良，可考慮檢測培養基中的谷氨酰胺含量確定是否再補加谷氨酰胺。市售商業(yè)化液體細胞培養基有具體的有效期，對于使用干粉細胞培養基自行配制成液體以后，也應低溫（2~8℃）貯存。除培養基中如谷氨酰胺易降解之外，培養基中的其他成份隨著(zhù)溫度的升高也可能會(huì )發(fā)生降解或是析出。

5、細胞培養基使用過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題分析

5.1、細胞培養基的緩沖系統選擇及pH變化問(wèn)題

由于大多數細胞適宜的pH為7.0~7.4，偏離此范圍可能對細胞生長(cháng)產(chǎn)生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養的細胞一般對pH變動(dòng)耐受力差，無(wú)限細胞系耐受力強。因此，原代培養時(shí)，培養液中的緩沖系統就顯得較為重要。一般的細胞培養基采用的都是平衡鹽系統，但不同的培養基或是同一系列的培養基所用平衡鹽系統不同，如199系列、MEM系列均有Hanks’系統的培養基及Earle’s系統的培養基。有些培養基不是上述常規的平衡鹽系統，例如RPMI1640培養基、F12培養基。MEM低血清培養基的平衡鹽系統也不是常規的平衡鹽系統，該平衡鹽系統的緩沖能力強于常規平衡鹽系統的緩沖能力。

細胞培養過(guò)程中pH值下降產(chǎn)生的原因有很多。在細胞生長(cháng)非?？鞎r(shí)，pH值通常下降得很快，此時(shí)可以通過(guò)及時(shí)傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進(jìn)行解決。此外，培養瓶蓋擰得過(guò)緊、NaHCO3緩沖系統緩沖能力不夠、培養液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌污染等也能導致pH值通常下降得很快。這時(shí)，可以通過(guò)以下幾種方法解決：

1）增加培養液中NaHCO3濃度或減少培養箱內CO2濃度。NaHCO3含量在2.0 g/L到3.7 g/L之間時(shí)對應的CO2濃度為5~10%；

2)改用不依賴(lài)CO2培養液；

3)適當松開(kāi)瓶蓋。在培養液中加HEPES緩沖液，使終濃度為10~25 mM；

4)在CO2培養環(huán)境中改用基于Earle’s鹽配制的培養液，在大氣培養環(huán)境中培養改用Hanks’鹽配制的培養液；

5)如果是污染造成的則丟棄培養物或用抗生素除菌。

5.2細胞培養基常用幾種重要的添加成份及使用過(guò)程中應注意的問(wèn)題

酚紅在細胞培養基中用作pH值的指示劑。一般情況下，可以通過(guò)酚紅的指示作用判斷培養基的pH值，但低血清或是無(wú)血清細胞培養基中酚紅的含量與普通細胞培養基中的酚紅含量不同，不能通過(guò)肉眼觀(guān)察或通過(guò)經(jīng)驗來(lái)判定pH值，建議使用pH計進(jìn)行測定。酚紅通常對含血清的細胞培養基生產(chǎn)的生物制品質(zhì)量并不會(huì )產(chǎn)生明顯影響，也可通過(guò)純化技術(shù)去除，但酚紅在無(wú)血清細胞培養基中可能帶來(lái)胞內鈉/鉀失衡，影響細胞生長(cháng)。

碳酸氫鈉在細胞培養基中主要是作為緩沖系統，此外還具有調節滲透壓的作用。通常產(chǎn)品使用說(shuō)明中的碳酸氫鈉推薦量是一個(gè)標準、安全量，是在科學(xué)的基礎上根據實(shí)踐經(jīng)驗所得。但是由于不同的細胞系（株）不同，同一株細胞適應環(huán)境也可能不同（細胞耐受性不同等），且存在的地域性水質(zhì)差異等，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中也可稍作改動(dòng)，但使用者需做相應的檢測（理化及細胞生產(chǎn)試驗等）。

HEPES是一種非離子緩沖液，在pH 7.2～7.4范圍內具有較好的緩沖能力，在高濃度時(shí)對一些細胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34 g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。其安全濃度范圍是10～25 mmol/L。

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是在沒(méi)有葡萄糖的條件下，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

谷氨酰胺在溶液中很不穩定，4℃下放置1周可分解50%，使用中-好單獨配制，置-20℃冰箱中保存，使用前加入細胞培養液中。