摘要：植物在遭遇鹽堿、干旱、重金屬、低溫、酸、機械刺激等非生物脅迫時(shí)，細胞膜電化學(xué)特性的變化和調節往往是最早發(fā)生的植物細胞反應之一，并與細胞內的生理代謝活動(dòng)之間存在復雜的聯(lián)系?；诖?，在過(guò)去的30年間，微電極離子流技術(shù)以其非損傷性、實(shí)時(shí)性、靈敏性和高分辨率等特有的技術(shù)優(yōu)勢，成為了研究逆境脅迫條件下植物的生理響應及調節機制常用的技術(shù)手段。從跟蹤監測界面反應、解析基因功能、進(jìn)行抗逆育種和研究信號物質(zhì)等方面綜述該技術(shù)在植物逆境脅迫生理研究中的應用，旨在為研究植物功能基因組學(xué)和調節植物對環(huán)境的適應性提供參考。

關(guān)鍵詞：微電極離子流技術(shù);逆境脅迫;離子流;活體;基因功能

中圖分類(lèi)號：Q945.78;Q-3文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0043-06

作者簡(jiǎn)介：趙怡琳（1998—），女，江蘇常州人，碩士研究生，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：1324822006 qq.com。

通信作者：汪曉麗，博士，副教授，主要從事植物營(yíng)養電生理研究。E-mail：xlwang yzu.edu.cn。

非損傷微測技術(shù)（non-invasivemicro-testtechnique，NMT），別稱(chēng)微電極離子流檢測（microelectrodeionfluxestimation，MIFE），最早由神經(jīng)科學(xué)家Jaffe于1974年提出原初概念[1]，如今開(kāi)始廣泛應用于動(dòng)植物科學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、醫學(xué)生理學(xué)、分子遺傳學(xué)等生物學(xué)領(lǐng)域，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的可進(jìn)行生理特征、生理功能動(dòng)態(tài)測量的研究新手段[2]。在植物抗逆方面，NMT以其特有的優(yōu)勢被眾多研究者用于干旱、高溫、低溫、鹽漬、重金屬、病原菌等非生物脅迫和生物脅迫的研究中[2]。研究受逆境脅迫后植物組織或細胞表面附近的離子流變化，對于揭示植物在遭遇逆境時(shí)的物質(zhì)跨膜轉運特征、生理響應機制和調節機制都具有重要意義。

1、非損傷微測技術(shù)的原理和特點(diǎn)

當細胞或組織不論以主動(dòng)還是被動(dòng)方式吸收離子和分子時(shí)，樣品表面的離子或分子濃度會(huì )發(fā)生變化，與環(huán)境濃度形成濃度差，從而產(chǎn)生電化學(xué)勢梯度。非損傷微測技術(shù)通過(guò)離子/分子選擇性微電極技術(shù)，玻璃電極在臨近樣品表面的一段微小的距離內來(lái)回移動(dòng)，同時(shí)測量電化學(xué)勢梯度，通過(guò)Nernst方程得到該距離內的離子或分子濃度差，并通過(guò)Fick第一擴散定律計算出流速，流速的正負符號反映了離子流或分子流移動(dòng)的方向[3]。

NMT具有活體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、直觀(guān)的優(yōu)點(diǎn)，并可以長(cháng)時(shí)間多維度地進(jìn)行離子/分子流測量與掃描[3]。該技術(shù)可用于各種生物組織或細胞的研究，可單獨或同時(shí)測量H+、Ca2+、K+、NH+4、Cd2+、NO-3、O2、H2O2等離子/分子，為生物學(xué)研究提供了良好的試驗系統平臺[4]。相比于傳統的微電極技術(shù)，其優(yōu)勢在于高靈敏度，兩者相差約6個(gè)數量級，而且在研究植物生理生態(tài)學(xué)過(guò)程中不須要破壞組織或細胞，能直接進(jìn)行活體測定，可以實(shí)時(shí)反映進(jìn)出植物體組織或細胞的離子/分子的動(dòng)態(tài)變化規律。

2、非損傷技術(shù)在植物抗逆中的應用

2.1、界面反應

植物在遭遇逆境時(shí)會(huì )有一系列的生理生化反應，從而表現出各種特有的響應和調節機制。細胞膜透性和功能的改變是植物對逆境條件最為直接和快速的響應[4]，進(jìn)而才是在細胞器或細胞質(zhì)中進(jìn)行的同化、代謝等生理過(guò)程。因此，從逆境條件下植物與外界環(huán)境之間的界面反應著(zhù)眼，探索界面上特征離子或關(guān)鍵離子的流動(dòng)速度和方向變化，對研究植物的逆境生理具有極為重要的意義。研究者們已對鹽漬、干旱、重金屬的脅迫方面進(jìn)行了廣泛的研究，所采用的生物材料、特征離子和測定部位等列于表1。

Sa等研究了楊樹(shù)在鹽脅迫下根表NO-3和H+的凈通量，非定植根表現出較強的凈NO-3外排，而真菌定植通過(guò)降低細胞膜表面pH值和抑制H+-ATP酶活性，阻止了NO-3的損失[5]。Tang等采用NMT研究了不同NaCl濃度下小果白刺（NitrariasibiricaPall.）根幼苗分生組織中Na+、K+和H+的流速，NaCl處理后，根系穩定的K+流出量逐漸減小，并顯著(zhù)增加了H+的流入[6]。Tang等研究了云杉根尖NH+4和NO-3的流速，在距離根尖13～15mm和8.0～10.5mm處檢測到NH+4和NO-3的最大凈流量，NH+4對云杉根尖吸收NO-3內流表現出明顯的抑制作用[7]。Chen等采用NMT測定大麥根部K+和Na+的流速，發(fā)現具有耐鹽性的大麥H+泵活性較高，膜電位較低，使根細胞更容易將Na+從細胞質(zhì)泵入外培養基[8]。Huang等對三葉柑桔根系H2O2流速進(jìn)行研究，發(fā)現菌根使主根和側根的H2O2外排量增加，從而減輕宿主植物干旱脅迫的氧化損傷[9]。Huang等使用NMT研究發(fā)現，湖北海棠（MalushupehensisRehd.）細根表面NO-3凈流入量下降，NH+4凈流入量明顯增加，說(shuō)明NH+4在提高海棠耐旱性方面可能發(fā)揮著(zhù)更重要的作用。在干旱脅迫下，2種銨轉運體（AMT4;2和AMT4;3）均顯著(zhù)上調，而大多數與硝酸鹽吸收、還原和氮代謝相關(guān)的基因均下調。在正常氮水平下，5%聚乙二醇處理植株的生物量產(chǎn)量、根系生長(cháng)和氮素吸收/減少值均高于低氮處理植株。這些結果表明，干旱脅迫對湖北海棠的不利影響可能隨著(zhù)氮素的增加而減輕[10]。Zhang等的研究結果表明，利用聚乙二醇（PEG）模擬的干旱條件下，棉花NO-3通量由凈流入變?yōu)閮袅鞒?，在距根?.3cm處有1個(gè)明顯的峰值[11]。對照條件下，檉柳（Tamarixramosissima）距根尖0.3cm處未觀(guān)察到明顯的NO-3流入信號，而PEG處理顯著(zhù)增強了檉柳距根尖0.3cm處NO-3的流入。Lv等首次制備了一種同時(shí)測定3種離子的氮化碳超靈敏微電極，用于測定水稻根表面不同位點(diǎn)Cu2+、Pb2+、Hg2+的流速[12]。Wu等研究了不同NO-3/NH+4比值對水稻根系吸收鎘（Cd）、木質(zhì)部轉位以及隨后Cd積累的生理和遺傳機制，結果表明，隨著(zhù)NH+4-N比例的增加，根毛區凈Cd2+流量受到抑制[13]。此外，2種劑量Cd處理下，木質(zhì)部汁液中Cd濃度也呈現出隨NH+4-N比值增加而下降的趨勢。增加銨態(tài)氮營(yíng)養有助于抑制水稻對Cd的吸收、木質(zhì)部運輸和隨后的積累。

2.2、解析基因功能

隨著(zhù)轉基因技術(shù)的發(fā)展，從植物的分子機制研究其抗逆機制也更為普遍。從分子學(xué)角度，植物抵御逆境是基因調控的結果。植物遭遇逆境時(shí)，通過(guò)啟動(dòng)或關(guān)閉某些相關(guān)基因，改變生理代謝活動(dòng)使植物適應逆境[13]。通過(guò)基因工程，將可能具有抗性的基因組導入擬南芥等模式植物中，研究基因組對植物抗逆的作用和機制?；蚪M學(xué)方法可以全面研究抗逆基因的功能和表達調控，并且把模式植物的抗逆信息推廣到基因組復雜的農作物上去[14]。同時(shí)可以克隆抗逆基因，在沒(méi)有抗性的植物中通過(guò)基因工程手段導入，改良作物的抗逆性[15]。

NMT在研究植物抗逆基因中的應用見(jiàn)表2。Fan等將海馬齒（Sesuviumportulacastrum）的SpAHA1基因轉錄入擬南芥中，使用NMT測定質(zhì)膜中Na+、H+和K+的流速，結果顯示，SpAHA1蛋白在胞質(zhì)膜上具有H+-ATPase的功能，SpAHA1蛋白通過(guò)增加質(zhì)子的電化學(xué)梯度來(lái)降低Na+的積累，促進(jìn)質(zhì)膜上Na+/H+反向運輸體的交換活性，在植物抵抗鹽堿逆境中起著(zhù)十分重要的作用[16]。擬南芥CYSTM3在耐鹽脅迫方面起著(zhù)負調控作用是Xu等運用NMT發(fā)現的，CYSTM3基因可以抑制擬南芥根系Na+外排，抑制一系列活性氧清除酶的活性[17]。Zhang等同樣研究了轉基因擬南芥，來(lái)自胡楊的PeJRL基因在NaCl脅迫下轉基因植株保留了K+，限制了Na+的積累[18]。PeJRL轉基因株系增加了Na+的外排量，這與編碼細胞膜SOS1、AHA1和AHA2基因的上調有關(guān)。PeJRL過(guò)表達植物中活化的H+-ATPases抑制了由NaCl誘導的去極化激活的K+通道介導的損失。此外，Cd2+借用Cu2+通道、Cu2+激活Ca2+通道等，均是Cd2+吸收增加的潛在機制。Zhang等的研究表明，MhMAPK4基因過(guò)表達降低了煙草根中Cd2+的凈流入量，轉基因煙草中Cd2+流入到穩定狀態(tài)的恢復時(shí)間也比野生型煙草短，MhMAPK4過(guò)表達降低了煙草根細胞的死亡和凋亡，MhMAPK4通過(guò)調節根對Cd2+的吸收來(lái)調節Cd的積累，通過(guò)調節液泡加工酶（VPE）的活性來(lái)控制Cd引起的細胞死亡[19]。Ma等鑒定了粳稻抗寒性的數量性狀位點(diǎn)為COLD。過(guò)表達COLD1基因可顯著(zhù)提高水稻的抗寒性，而缺乏或低表達COLD1基因的水稻對寒冷敏感。COLD1編碼定位于細胞膜，是內質(zhì)網(wǎng)的G蛋白信號調節因子。它與G蛋白相互作用，激活Ca2+通道感知低溫，加速G蛋白GTPase活性，使水稻具有抗寒性[20]。Zhou等使用NMT分析顯示，轉基因擬南芥根在冷沖擊下Ca2+內流增加。在冷脅迫下，胞質(zhì)Ca2+作為信號分子的增加激活了下游COR基因的表達。因此，Ca2+的流入可能導致轉基因擬南芥COR基因表達增加[21]。

2.3、抗逆育種

傳統方法篩選具有抗性的植物品種較為耗時(shí)費力。非損傷微測技術(shù)的活體動(dòng)態(tài)測量，使試驗周期縮短，能較為快速地進(jìn)行選種育種。由于不同品種的植物在逆境下的生理生化反應不同，所表現出的離子流特征也各有不同。將具有耐性的品種與沒(méi)有耐性的品種作對比試驗，了解其抗逆機制，總結具有耐性品種的離子流特征，建立抗性辨識模型。通過(guò)測定植物組織或器官具有特征性的一種或多種離子/分子流，來(lái)判斷該植物是否具有抗性，從而進(jìn)行抗逆育種。

Liu等對馬鈴薯二倍體和六倍體根系K+、H+、Ca2+和Na+的凈通量進(jìn)行研究，結果表明在鹽脅迫下，在根和葉組織中六倍體比二倍體保留更多的K+，積累更少的Na+。六倍體由于質(zhì)膜Ca2+通道對H2O2的高敏感性，有效地將Na+區隔在伸長(cháng)和成熟根區[22]。Chen等為進(jìn)一步了解大麥耐鹽性性狀的遺傳行為，在6個(gè)大麥品種間進(jìn)行半雙列雜交，以已知耐鹽性品種為對照，研究在鹽脅迫條件下植物根系K+損失為基礎的耐鹽性配合力。耐鹽品種CM72和Numar表現出較高的一般配合力（GCA），有較高的耐鹽性（在鹽脅迫下K+損失量較?。23]。毛桂蓮等研究灌木葉片凈Na+、K+和Ca2+流速，發(fā)現在NaHCO3脅迫下，3種灌木通過(guò)不同的策略來(lái)消除Na+毒害。寧夏枸杞葉片通過(guò)將Na+外排來(lái)降低鈉毒害，而2種濱藜是將Na+區隔化，在葉表皮形成鹽腺[24]。Zhang等測定茶樹(shù)葉片K+流速，模擬干旱脅迫誘導的茶葉細胞中K+外排與12個(gè)茶樹(shù)品種的整體耐旱性呈較強的負相關(guān)。與此相一致的是，耐旱品種葉片K+的殘留量明顯高于敏感品種。外源施用K+顯著(zhù)減輕了茶樹(shù)的干旱誘導癥狀，說(shuō)明K+的保留是茶樹(shù)耐旱機制的重要組成部分。藥理試驗結果表明，耐干旱和敏感茶樹(shù)品種間，K+向外整流通道和非選擇性陽(yáng)離子通道對PEG誘導的葉肉細胞K+外排的控制作用是不同的[25]。

2.4、信號物質(zhì)

植物感受脅迫信號，Ca2+在信號傳遞過(guò)程中發(fā)揮不可缺少的作用。Ca2+調節植物對環(huán)境脅迫的反應，在脅迫條件下，胞內Ca2+常常顯著(zhù)增加，可以啟動(dòng)相關(guān)基因激活一系列生化反應，使植物能夠適應環(huán)境脅迫[26]。Ca2+還能誘導相關(guān)蛋白合成，激活酶活性，參與活性氧的產(chǎn)生，使植物抗性增強[26]。使用非損傷微測技術(shù)檢測Ca2+流，能較為方便直觀(guān)地觀(guān)察到逆境下Ca2+流速和方向的變化，可以進(jìn)一步研究Ca2+流對其他離子/分子流的影響，探究鈣信使在植物抗逆過(guò)程中起的作用。

Lang等通過(guò)研究甘草（Glycyrrhizauralensis）根部Na+和K+流速發(fā)現，鹽脅迫會(huì )提高在調節K+/Na+平衡中起信號分子作用的Ca2+、H2O2、NO、胞外ATP水平，促進(jìn)Na+的外流，抑制K+的損失[27]。Chao等研究了鈾脅迫下鬼臼菌根（Syngoniumpodophyllum）根部Ca2+流速，結果表明，黑曲霉能抑制根細胞的鈣外排，從而減弱了鈾對植物生長(cháng)的毒害作用[28]。在干旱脅迫下，H2S介導離子通量誘導擬南芥氣孔關(guān)閉是Jin等通過(guò)測定擬南芥葉片H+、Ca2+、K+和Cl-流速發(fā)現的，此外還發(fā)現內源性H2S在不影響H+流量的情況下，可誘導跨膜K+流出以及Ca2+、Cl-流入[29]。Rodrigo-Moreno等研究了銅脅迫下不同擬南芥根部的離子轉運情況，發(fā)現低濃度的Cu2+刺激根尖Ca2+內流，但未刺激成熟區，銅誘導K+外排并且在銅暴露后，根尖的基礎過(guò)氧化積累有所減少。銅會(huì )在胞質(zhì)中產(chǎn)生羥自由基，從而調控細胞膜羥自由基敏感性的Ca2+和K+轉運系統[30]。

3、離子流與植物抗逆的聯(lián)系

在逆境中植物往往會(huì )受到滲透脅迫、離子失調、膜透性改變、生理代謝紊亂等危害，植物對逆境的生理方面的適應變化包括改變生物膜透性、形成逆境蛋白、產(chǎn)生抗氧化防御系統、進(jìn)行滲透調節等[31]，其中滲透調節物質(zhì)包括細胞與外界進(jìn)行無(wú)機離子交換，如K+、Na+[31];細胞內合成有機物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等[31]。因此在植物抗逆生理過(guò)程中進(jìn)行滲透調節會(huì )伴隨著(zhù)H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物液泡或細胞。非損傷微測技術(shù)的試驗結果直接反映的是離子流速，從吸收或外排的離子動(dòng)態(tài)變化角度可以體現植物細胞的滲透調節，表現出植物的抗逆能力。

植物抵抗鹽堿脅迫，可以通過(guò)細胞質(zhì)膜上的H+-ATP酶將H+泵到胞外，形成跨膜的H+濃度梯度從而驅動(dòng)Na+/H+反向運輸體將細胞內的Na+排出，同時(shí)也抑制了K+外流。Chen等對具有較強耐鹽堿脅迫能力的壇紫菜進(jìn)行了研究，結果表明，與對照海草相比，壇紫菜具有較高的K+/Na+比值。壇紫菜通過(guò)Na+/H+反載體將Na+外排，同時(shí)降低了海鹽藻脫極化激活通道K+的損失，在鹽脅迫下維持Na+/H+的穩態(tài)，使壇紫菜具有抗高鹽脅迫能力[32]。Ca2+在植物干旱脅迫中，是植物細胞內重要的調節生理功能的信號物質(zhì)。郎濤等研究發(fā)現，胞外ATP、H2O2、Ca2+、NO等鹽脅迫信號是通過(guò)上調紅樹(shù)根系細胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉運體系活性，在促進(jìn)Na+和H+逆向跨膜轉運的同時(shí)，抑制K+外流[33]。

植物抵抗干旱脅迫主要通過(guò)細胞進(jìn)行滲透調節來(lái)保持吸水能力[34]，在根尖細胞的無(wú)機滲透調節物質(zhì)，如K+、Cl-能保持滲透壓力和水分梯度，有利于細胞在干旱下維持水分。植物葉片的氣孔開(kāi)閉也與K+密切相關(guān)，保衛細胞中K+外排使水勢上升，氣孔關(guān)閉，減少植物蒸騰作用。Mak等研究發(fā)現，PEG誘導的短期離子通量響應不同于植物在長(cháng)期真實(shí)干旱條件下的離子通量，長(cháng)期干旱導致H+流入量更小，K+和Ca2+的流出量更大[35]。聚乙二醇誘導的干旱和實(shí)際干旱條件在調節這些化學(xué)信號和膜傳輸系統方面可能是不同的。在PEG短期誘導的大豆基因表達和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，沒(méi)有發(fā)現負責K+、H+和Ca2+通量的轉運體發(fā)生變化，說(shuō)明短期脅迫時(shí)離子的流入流出是植物的應激反應。

植物對重金屬的排斥包括分泌化合物降低有效性、回避攝入、限制運輸和排出體外[36]，研究者們通過(guò)NMT研究植物對重金屬的吸收機制。Ma等研究發(fā)現，有硅培養的細胞與無(wú)硅培養的細胞相比，凈Cd2+內流顯著(zhù)減少[37]。因為細胞壁中64%的硅在細胞壁分離后與半纖維素成分結合，從而抑制了鎘的吸收。有硅培養的細胞壁表面電位的異質(zhì)性高于無(wú)硅培養的細胞壁表面電位的異質(zhì)性，且在添加鎘后均質(zhì)化。

4、問(wèn)題與展望

由于全球氣候變化加劇，鹽堿化、干旱、洪澇、低溫、高溫等環(huán)境問(wèn)題愈發(fā)嚴重，對植物的生存生長(cháng)不利。多數植物通過(guò)調節自身生理機能對逆境有不同的抵抗機制，在生理調節過(guò)程中往往伴隨著(zhù)H+、Ca2+、K+、Cl-、Na+、H2O2等離子/分子流入或流出植物體的過(guò)程，通過(guò)NMT進(jìn)行離子/分子流的研究能夠從全新角度闡述植物的抗逆機制，獲得常規方法難以獲得的全新發(fā)現[4]。NMT直接在根、葉片細胞等活體植物樣品上，在不損傷細胞膜的情況下獲得離子/分子流速，不僅能夠研究植物抵抗逆境的生理生化反應、微觀(guān)上基因調控的機制，還能夠通過(guò)對植物耐性機制的研究，篩選具備優(yōu)良性狀的生物品種。但非損傷微測技術(shù)在植物抗性研究方面也存在不足，多數植物都具有抵抗逆境的能力，所能獲得的植物材料有很多，檢測的離子或分子也多種多樣，不同的離子/分子流速在不同的植物材料中有不同的變化趨勢，但建立抗性辨識模型的比較少，沒(méi)有具體的評價(jià)指標。目前的研究大多僅是單方面采用NMT在植物某一生長(cháng)時(shí)期進(jìn)行離子或分子流速的測定，而研究植物的長(cháng)期演化過(guò)程是動(dòng)態(tài)連續的，各要素間存在復雜的互作關(guān)系，須要將NMT應用于植物整個(gè)生命周期的不同發(fā)育階段的研究中[4]。

非損傷微測技術(shù)在理論研究和試驗實(shí)踐中，研究不斷深入，探測范圍不斷擴大，技術(shù)不斷完善，非損傷微測技術(shù)必將更準確、更全面地揭示植物體離子跨膜運動(dòng)與植物生理功能之間的關(guān)系[2]。關(guān)于非損傷微測技術(shù)本身的改進(jìn)，可以增加可檢測的離子/分子種類(lèi)，探究植物體生命活動(dòng)規律中不同離子/分子所起的作用，發(fā)現更多植物特定的離子/分子流速的變化趨勢，形成特征性圖譜。隨著(zhù)可檢測的離子/分子種類(lèi)增多，非損傷微測技術(shù)須加快技術(shù)革新，每次單一測定一種離子/分子已經(jīng)不能滿(mǎn)足要求，須要發(fā)展多通道離子檢測技術(shù)，更便捷地同時(shí)測定多種離子/分子，有效發(fā)揮實(shí)時(shí)、活體測定離子/分子的優(yōu)勢。對于該技術(shù)的應用技巧方面，完整活體植株固定在操作平臺上測定時(shí)根系易晃動(dòng)，使用濾紙和小瓷片壓住樣品根系;植物材料相同品種間根系活力差異較大，在準備樣品時(shí)選擇較為強盛的根系，并多做平行試驗;儀器反應太靈敏，容易產(chǎn)生基線(xiàn)漂移，須在測定同種離子流不同品種時(shí)進(jìn)行多次校準;試驗環(huán)境要求較高，由于樣品容易晃動(dòng)，數據容易受環(huán)境影響而產(chǎn)生波動(dòng)。還須進(jìn)一步改進(jìn)試驗條件。非損傷微測技術(shù)也應與其他先進(jìn)檢測技術(shù)結合研究，如熒光顯微、分子生物學(xué)、微域分析等，從不同層次不同角度全方位揭示植物的生理生化過(guò)程，逐步完善植物長(cháng)期演化過(guò)程的應用研究體系。拓展非損傷微測技術(shù)的應用領(lǐng)域需要豐富樣品的品種、類(lèi)型以及不同的測試部位，如微管形成層、木質(zhì)部等。同時(shí)新的逆境條件出現在不斷出現，如納米物質(zhì)、病蟲(chóng)害等，了解植物在新逆境條件下的適應性與植物的生理生化機制，從而推廣非損傷微測技術(shù)在植物抗逆以及各領(lǐng)域研究中的應用。

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