熱線(xiàn):021-56056830,66110819
手機:13564362870
熱線(xiàn):021-56056830,66110819
手機:13564362870
離子通道結構和功能的研究需綜合應用各種技術(shù),包括:電壓和電流鉗位技術(shù)、單通道電流記錄技術(shù)、通道蛋白分離、純化等生化技術(shù)、人工膜離子通道重建技術(shù)、通道藥物學(xué)、基因重組技術(shù)及一些物理和化學(xué)技術(shù)。
1、電壓鉗位技術(shù)
一般而言,膜對某種離子通透性的變化是膜電位和時(shí)間的函數。通過(guò)玻璃微電極與細胞膜之間形成緊密封接,利用電子學(xué)技術(shù)施加一跨膜電壓并把膜電位固定于某一數值,可以測定該膜電位條件下離子電流隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程。利用藥物或改變細胞內外的溶液成分,使其他離子通道失效,即可測定被研究的某種離子通道的功能性參量,分析離子電流的穩態(tài)和動(dòng)力學(xué)與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系,可推斷該種通道的電導、活化和失活速率、離子選擇性等,并能測量和分析通道的門(mén)控電流的特性。
2、單通道電流記錄技術(shù)
又稱(chēng)膜片鉗位技術(shù),用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面,使之形成10~100GΩ的密封(giga-seal),被孤立的小膜片面積為μm2量級,內中僅有少數離子通道。然后對該膜片實(shí)行電壓鉗位,可測量單個(gè)離子通道開(kāi)放產(chǎn)生的pA(10-12安培)量級的電流,這種通道開(kāi)放是一種隨機過(guò)程。通過(guò)觀(guān)測單個(gè)通道開(kāi)放和關(guān)閉的電流變化,可直接得到各種離子通道開(kāi)放的電流幅值分布、開(kāi)放幾率、開(kāi)放壽命分布等功能參量,并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關(guān)系。還可把吸管吸附的膜片從細胞膜上分離出來(lái),以膜的外側向外或膜的內側向外等方式進(jìn)行實(shí)驗研究。這種技術(shù)對小細胞的電壓鉗位、改變膜內外溶液成分以及施加藥物都很方便。
3、通道藥物學(xué)研究
應用電壓鉗位或單通道電流記錄技術(shù),可分別于不同時(shí)間、不同部位(膜內側或外側)施用各種濃度的藥物,研究它們對通道各種功能的影響。結合對藥物分子結構的了解,不但可以深入了解藥物和毒素對人和動(dòng)物生理功能作用的機制,還可以從分子水平得到通道功能亞單位的類(lèi)型和構象等信息。
4、通蛋離、通建和基重術(shù)
利用與通道特異結合的毒劑標記,可把通道蛋白質(zhì)從膜上分離下來(lái),經(jīng)過(guò)純化,可以測定各亞單位多肽的分子量。然后,把它們加入人工膜,可重新恢復通道功能。用于確定蛋白質(zhì)氨基酸序列的基因重組技術(shù)的程序是:從細胞中分離出含有與該種通道蛋白相關(guān)的mRNA,置入某種細胞(如大腸桿菌),經(jīng)逆轉錄得到cDNA。用限制性?xún)惹忻笇DNA切割成特定片段,再用核酸雜交方法釣出特定的DNA并克隆化。通過(guò)測定陽(yáng)性克隆DNA的核苷酸順序,推斷出相應的蛋白質(zhì)氨基酸序列。