氫氣(H2)無(wú)色無(wú)味，是自然界最小的分子，同時(shí)也是宇宙中含量最多的元素。過(guò)去H2被認為是生物惰性氣體。近年來(lái)，隨著(zhù)對其生物學(xué)功能的深入研究，研究人員認為H2可能是繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氫(H2S)之后又一個(gè)重要的氣體信號分子。2007年Ohsawa等發(fā)現氫氣可顯著(zhù)改善腦缺血再灌注損傷，由此引起了對于氫氣的研究熱潮。研究表明，H2對多種人類(lèi)疾病和病理狀態(tài)都具有明顯的緩解和治療效果，如氫分子在抗氧化、抗炎癥等方面都發(fā)揮著(zhù)重要作用。此外，H2在植物學(xué)上也具有重要的生理作用，其不僅可提高植物對生物/非生物脅迫的抗性，還參與調控植物的生長(cháng)發(fā)育。

目前飲用富氫水(hydrogen-rich water，HRW)是常用的攝取氫的方式，水相中氫氣濃度的準確測定是各項研究以及后續生產(chǎn)應用的前提和基礎。

目前，測定溶液中氫氣濃度的方法主要有電極法、氣相色譜法和氧化還原滴定法。電極法是通過(guò)測定溶液中氧化還原電位的變化而確定溶液中氫氣的濃度；氣相色譜法主要依據樣品成分與色譜柱沸點(diǎn)、極性或吸附性的不同，氣體通過(guò)色譜柱時(shí)被分離，各種物質(zhì)到達檢測器時(shí)間有所不同，從而可以對待測組分進(jìn)行定性和定量測定；氧化還原滴定法是利用亞甲基藍在膠體鉑催化下與氫氣發(fā)生氧化還原反應使亞甲基藍褪色，通過(guò)亞甲基藍的用量計算出溶液中氫氣的含量，但此方法誤差較大，且準確度不高。

基于此，本研究利用氫氣微電極和檢測小體系溶液中氫氣濃度的可行性，以期建立一種可廣泛用于氫氣生物學(xué)研究和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的氫氣濃度檢測方法。

實(shí)驗材料與儀器設備

標準氮氣、氧氣購自北京誠為信氣體有限公司。Milli-Q Advantage A10純水設備購自美國Millipore公司；ZK-300純水氫氣發(fā)生器購自北京中科匯恒技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；氫氣微電極購自丹麥Unisense公司，SH-RtTM-Msieve 5A色譜柱；氣相色譜瓶購自美國安捷倫科技有限公司。

飽和HRW的制備

將純水氫氣發(fā)生器制得的氫氣(99.999%)通入100 mL超純水(ddH2O)中以制備HRW，每隔10 min使用氫氣微電極測定一次，直至飽和，氫氣在20℃下溶解度為1.62 mg·L-1[20]。制得飽和HRW后，立即使用ddH2O稀釋?zhuān)渲瞥刹煌瑵舛鹊腍RW(表1)以用于測定標準曲線(xiàn)，溶液總體系為500.0μL。

表1高濃度和低濃度HRW配制

電極法測定HRW中氫氣濃度

電極極化

將氫氣微電極浸泡于ddH2O中，電極極化電壓設置為1 000 mV，隨后逐漸下降，并最終穩定在某一數值，待此數值穩定10 min以上后，電極極化結束，可以開(kāi)始樣品檢測。電極極化時(shí)間一般需要1～2 h。

樣品檢測

將500μL不同濃度的HRW置于1.5 mL離心管中，將電極插入液面以下，待信號值穩定后，記錄數據。

結果

電極法測定水相中氫氣濃度

標準曲線(xiàn)

利用氫氣微電極分別測定高濃度HRW(0、0.324 0、0.648 0、0.972 0、1.296 0、1.620 0 mg·L-1)及低濃度HRW(0、0.040 5、0.081 0、0.121 5、0.162 0、0.202 5 mg·L-1)中氫氣的濃度。以水相中氫氣濃度為縱坐標，以氫電極的信號值為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)。如圖1A所示，高濃度HRW標準曲線(xiàn)方程為y=0.001 402x-0.028 35，相關(guān)系數(R2)為0.999 8；如圖1B所示，低濃度HRW標準曲線(xiàn)方程為y=0.001 580x-0.030 28，R2=0.999 7。因此，低濃度、高濃度HRW中，水相中氫氣濃度與氫氣微電極信號值之間均具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

圖1氫電極法檢測水相中氫氣濃度標準曲線(xiàn)

精確度分析及檢出限分析

利用氫氣微電極對某一高濃度(0.72 mg·L-1)、低濃度(0.012 mg·L-1)樣品進(jìn)行9次平行測定，對該測定方法進(jìn)行精確度分析，由表2可知在0～1.620 0 mg·L-1范圍內，該方法的標準偏差為0.012 9 mg·L-1，變異系數為1.775 3%。結果表明該方法精確度較高，滿(mǎn)足水相中高濃度氫氣的測定要求。

表2電極法檢測高濃度和低濃度HRW的精確度分析

由表2可知,在0～0.202 5 mg·L-1范圍內，用電極法測定低濃度HRW的樣品的標準偏差為0.001 3 mg·L-1，變異系數為11.734 0%。根據1.5中的公式，t(8,1-a=0.99)=3.355 0，MDL=S×t(8,1-a=0.99)=0.004 4 mg·L-1。表明該方法精確度較高，滿(mǎn)足水相中低濃度氫氣的測定要求。

綜上所述，對于需要實(shí)時(shí)監測的樣品，使用氫微電極法較為合適。從檢測方式來(lái)看，電極法可以直接實(shí)時(shí)監測水相中氫氣的濃度；但從測定原理來(lái)看，電極法根據溶液中氧化還原電位的變化而測定溶液中氫氣的含量，由于生物樣本成分較為復雜，電極法的測定結果容易受到多種因素的干擾。