解鎖腦功能是探究病理性腦網(wǎng)絡(luò )功能障礙的必要條件。由于中樞神經(jīng)系統形態(tài)和生化的復雜性，開(kāi)發(fā)具有預測能力的通用模型必須從體外腦網(wǎng)絡(luò )工程入手?；诖?，本研究實(shí)現了一個(gè)基于微電極陣列(MEA)的體外腦網(wǎng)絡(luò )，通過(guò)體外腦網(wǎng)絡(luò )對腦功能控制和病理性腦網(wǎng)絡(luò )功能障礙進(jìn)行了研究，并比較了不同類(lèi)型的神經(jīng)元簇的動(dòng)態(tài)特性。研究結果顯示，腦起搏神經(jīng)元在產(chǎn)生腦網(wǎng)絡(luò )電生理模式中起著(zhù)重要作用，并可能與神經(jīng)可塑性過(guò)程有關(guān)。這些發(fā)現為未來(lái)的計算模型發(fā)展提供了有關(guān)生理和病理條件下腦網(wǎng)絡(luò )行為的重要信息。

微電極陣列(MEAs)上的聚合物裝置：使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)約束來(lái)塑造網(wǎng)絡(luò )連通性。本研究實(shí)現了兩種類(lèi)型的PDMS約束:十字形和圓形掩模。第一種由等臂十字形掩模(圖1a)組成，用于將MEA的有源區域劃分為四個(gè)部分，實(shí)現四個(gè)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )系統(4N)。第二種采用圓形掩模實(shí)現單神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )系統(1N)。兩種類(lèi)型的掩膜都是通過(guò)將PDMS預聚物和固化劑以10:1的比例混合制成，然后對準并可逆地結合到平面微電極陣列(MEAs)上。

實(shí)驗動(dòng)物：采用第18-19天的Sprague-Dawley胚胎大鼠(E18-19)作為實(shí)驗對象。用E18-19胚胎的大腦皮層制備大鼠皮層神經(jīng)元原代培養物。將神經(jīng)元原代培養物置于培養基中培育，使神經(jīng)元組織成形態(tài)和功能成熟的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )(圖1b)，再進(jìn)行免疫熒光染色。

圖1.(a)十字形PDMS掩模在MEA上的定位。黑點(diǎn)表示電極位置；左邊的黑色梯形形狀代表參比電極。MEA的有效區域由1.8 mm×1.4 mm矩形的4個(gè)電極簇組成，其中每個(gè)電極簇由13個(gè)電極組成(?=30μm)，另外7個(gè)電極位于簇之間。(b)具有代表性的四神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )(4N)在體外(DIV)18天的免疫熒光圖像，其中樹(shù)突狀微管相關(guān)蛋白(MAP2，綠色)和細胞核(DAPI，藍色)被標記。代表性4N培養物的免疫熒光圖像(c)在DIV 5，(d)DIV 8，(e)DIV 18。在兩個(gè)不同的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )(簇)之間建立軸突連接，其中樹(shù)突微管相關(guān)蛋白(MAP2，綠色)和軸突微管相關(guān)蛋白(Tau，紅色)被標記。在DIV 5移除十字形掩膜。白色的疊加線(xiàn)劃定了之前被十字形掩模占據的區域。比例尺:100μm。

數據集和實(shí)驗方案：本研究中使用的數據集包括16個(gè)四網(wǎng)絡(luò )系統(4N)和11個(gè)單網(wǎng)絡(luò )系統(1N)作為對照。為了比較4N和1N組件之間時(shí)間序列的激活，將控制網(wǎng)絡(luò )的微電極分組為“虛擬集群”，每個(gè)微電極由13個(gè)單元組成，以保持與4N組件相同的空間組織。此外，為了研究超極化激活的環(huán)核苷酸門(mén)控(HCN)通道的作用，記錄了3個(gè)單網(wǎng)絡(luò )系統(1N)的活性，通過(guò)計算平均放電速率(MFR)抑制的IC50，得出了HCN抑制劑-伊伐布雷定(IVB)合適濃度的劑量-反應曲線(xiàn)。一旦得出這樣的值(15μM)，在1N上進(jìn)行5次記錄以評估IVB效應。

數據分析：為了檢測脈沖的發(fā)生，本研究采用了精確時(shí)間脈沖檢測(PTSD)算法。

結果

本研究首先探索并表征了體外互聯(lián)亞群(4N)相互作用所產(chǎn)生的自發(fā)活動(dòng)，指出了它們作為起搏器/優(yōu)勢群體的作用。結果與不顯示模塊化連接的皮質(zhì)網(wǎng)絡(luò )(1N)進(jìn)行了比較。直到神經(jīng)元亞群由于PDMS十字形掩膜的存在而保持隔離(圖1a)，它們才在每個(gè)隔室內建立了密集的連接(圖1b)；在去除約束后(DIV 5，體外第5天)，種群之間的空間完全沒(méi)有任何類(lèi)型的神經(jīng)性樹(shù)枝(圖1c)。隨后，細胞體開(kāi)始在裂縫中擴展其樹(shù)突，在PDMS移除3天后(DIV 8)，神經(jīng)突束開(kāi)始向其他亞群擴展，尋找可能的目標(圖1d)。在DIV 18(記錄當天)，集群之間的遠程連接結構良好，足夠豐富，可以保證子種群之間的有效連接(圖1e)，支持物理模塊化連接的證據。

由模塊化程度調制的峰值和爆發(fā)特征

獨立于網(wǎng)絡(luò )拓撲類(lèi)型(即4N或1N)，體外皮層網(wǎng)絡(luò )表現出自發(fā)的電生理活動(dòng)，其特征是豐富的動(dòng)態(tài)庫，從峰值和爆發(fā)信號到通過(guò)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)的網(wǎng)絡(luò )全局激活。這種行為與耦合到MEA的同質(zhì)網(wǎng)絡(luò )和集群網(wǎng)絡(luò )是一致的。通過(guò)比較1N與4N引起的電生理活動(dòng)，發(fā)現在峰值和破裂活動(dòng)方面存在顯著(zhù)差異：1N網(wǎng)絡(luò )的MFR值高于4N(圖2a)，MBR(圖2b)和BD(圖2c)也高于1N網(wǎng)絡(luò )。事實(shí)上，IBI值呈現相反的趨勢(圖2d)。峰值和爆發(fā)統計的宏觀(guān)指標由皮質(zhì)集合的網(wǎng)絡(luò )組織調節，而以網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)次數(NB，圖2e)和網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)持續時(shí)間(NDB，圖2f)為特征的集體活動(dòng)沒(méi)有顯示出顯著(zhù)差異。

圖2.單網(wǎng)絡(luò )(1N，黑色)和四網(wǎng)絡(luò )(4N，藍色)組件中的峰值和爆發(fā)活動(dòng)。(a)平均發(fā)射速率(MFR)，(b)平均爆發(fā)率(MBR)，(c)爆發(fā)持續時(shí)間(BD)，(d)爆發(fā)間隔(IBI)，(e)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)數，(f)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)持續時(shí)間(NBD)。(a-d、f)每個(gè)數據點(diǎn)表示相對于單個(gè)電極的特定度量(MFR,MBR等)的值。(e)每個(gè)數據點(diǎn)相對于多邊環(huán)境協(xié)定。

由模塊化形成的節律性活動(dòng)

網(wǎng)絡(luò )拓撲并沒(méi)有塑造網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)的宏觀(guān)度量(圖2e和2f)，相反，它們的傳播“模式”受到了影響。為了量化電生理活動(dòng)的傳播，本研究估計了IFR(瞬時(shí)發(fā)射速率)。圖3a顯示了1N控制網(wǎng)絡(luò )的代表性示例。這四條彩色軌跡代表了用于研究網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)的四個(gè)“虛擬集群”。在圖3a所示的代表性實(shí)驗中，種群事件遵循順時(shí)針傳播。通過(guò)對集群進(jìn)行顏色編碼，網(wǎng)絡(luò )從紫色集群開(kāi)始爆發(fā)，然后擴散到青色、綠色和紅色集群。另一方面，在圖3b所示的4N中，可以觀(guān)察到與在1N中觀(guān)察到的相比，簇之間的傳播模式更多變化，更少定型。本研究還表示了三個(gè)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)的IFR曲線(xiàn):第一個(gè)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)顯示了逆時(shí)針傳播，涉及所有四個(gè)相互連接的種群(青色-紫紅色-綠色)，第二個(gè)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)只涉及三個(gè)亞種群(青色缺失)，第三個(gè)網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)涉及所有隨機序列的群集(既不是順時(shí)針也不是逆時(shí)針)。

圖3.代表性的(a)單網(wǎng)絡(luò )(1N)和(b)四網(wǎng)絡(luò )系統(4N)的60 s電生理活動(dòng)周期。5-s時(shí)間窗對應的瞬時(shí)發(fā)射速率分布在頂部，以及簇激活序列的傳播圖草圖。每種顏色表示一個(gè)“虛擬”(1N)或4N集群，而箭頭表示集群之間的網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)傳播。在1N的情況下，涉及到所有的虛擬集群，而在4N的情況下，第一次和第三次網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)涉及到所有的集群，而第二次網(wǎng)絡(luò )爆發(fā)沒(méi)有涉及到青色集群。

探討與結論

本研究使用體外實(shí)驗模型探索了腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的電生理活動(dòng)模式，并揭示了起搏神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)可塑性在網(wǎng)絡(luò )行為中的重要性。通過(guò)體外實(shí)驗模型，可以對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )進(jìn)行精細控制和觀(guān)察，從而深入研究網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)的基本特征。體外模型的實(shí)驗設計允許研究人員探索拓撲連接和神經(jīng)可塑性對網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)的影響，為腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )行為的底層機制提供了重要線(xiàn)索。然而，這項研究是在體外實(shí)驗模型中進(jìn)行的，盡管與體內情況相似，但仍無(wú)法完全模擬大腦的復雜性。并且在模擬大腦功能和病理條件時(shí)，仍需要更多的研究和實(shí)驗來(lái)驗證體外模型的準確性和可重復性。

圖4.這項工作的原理和未來(lái)展望。主要思想是重新創(chuàng )建與微電極陣列(MEA)耦合的互連神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò )，以提取、檢查和定量表征其電生理活動(dòng)。利用這種方法，我們可以開(kāi)發(fā)出再現所觀(guān)察到的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)的計算機模型(數字雙胞胎)，從而預測神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的生理行為。從這個(gè)角度來(lái)看，計算模擬有助于理解神經(jīng)系統疾病的病因和進(jìn)展。

總的來(lái)說(shuō)，本研究證實(shí)了腦起搏神經(jīng)元活動(dòng)和神經(jīng)可塑性在體外神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的自發(fā)活動(dòng)中的重要作用。實(shí)驗結果顯示，腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )活動(dòng)具有起搏神經(jīng)元依賴(lài)的節律性和時(shí)空固定的模式，可能與神經(jīng)可塑性有關(guān)。這些發(fā)現提供了發(fā)展計算模型、理解大腦網(wǎng)絡(luò )行為和治療神經(jīng)系統疾病的重要線(xiàn)索。另外，體外模型的應用還可以拓展到轉化醫學(xué)研究領(lǐng)域，用于研究神經(jīng)系統疾病的機制和評估藥物或刺激方案的效果。