深海水域的微生物氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，但人們對其研究甚少，主要是方法上的困難較多。尤其是微生物的呼吸測量是具有挑戰性的，因為需要高分辨率的氧氣濃度測量設備。最近關(guān)于氧傳感技術(shù)（丹麥unisense研發(fā)的微電極技術(shù)）的改進(jìn)克服當下研究這些問(wèn)題的局限性具有很大的潛力。本論文的研究人員主要比較了三種不同的方法來(lái)測量低氧濃度下的耗氧量，利用克拉克型氧傳感器(STOX)，光學(xué)氧傳感器(optodes)，質(zhì)譜結合18-18O2標記法。研究人員通過(guò)在不同的方法中，以及同樣的實(shí)驗設置中，對比研究三種方法的氧濃度和耗氧量一致性評價(jià)，并采用高耗氧量法測定了30-400 nmol L-1h-1的耗氧量精度及相對標準誤差。

Unisense微電極測量系統的的應用

unisense公司的氧氣微電極(STOX)應用于水生生物的氧的消耗及消耗速率的測試。STOX氧氣微電極采用傳統的兩點(diǎn)法進(jìn)行矯正，研究過(guò)程中將STOX型微電極插入到特制的玻璃瓶中，測試玻璃品的水生生物的耗氧速率，并同步采用光學(xué)氧傳感法及質(zhì)譜法測試含有水生生物的玻璃瓶中的氧的消耗速率。

實(shí)驗結果

研究發(fā)現所有方法均適用于O2消耗量的檢測，反應速率在幾個(gè)nmol L-1h-1和低濃度O2的范圍內，研究結果測試出了海洋環(huán)境下的海洋生物預期的氧的消耗速率。其中氧的消耗速率的具體限制需要控制如微電極傳感器的漂移(STOX)和氧的污染(Exetainer)的最小化以達到低檢測限，并充分利用傳感器帶來(lái)的特定精度和測量頻率。潛在檢測限為24小時(shí)潛伏期為幾個(gè)nmol L-1h-1或更少，但各有差異的方法。對于連續測量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光電法。研究發(fā)現在低氧濃度下培養是一個(gè)特殊的挑戰，比如聚集體的存在是否可以限制擴散速率預期濃度低于20umol L-1，并要考慮有限的氧氣消耗的本身擴散，樣品需要更加精細化的處理，以便更好地在原位條件下繁殖并考慮到其聚合體的大小和分布。

圖1、實(shí)驗培養裝置圖。孵育瓶置于恒溫水浴中。兩個(gè)光學(xué)氧傳感器被放置在瓶的上半部分相對的兩側。該STOX傳感器是通過(guò)一個(gè)玻璃管插入瓶的中心。校正的過(guò)程是通過(guò)壓力補償口加入已知的空氣飽和量的水。容器下方通過(guò)磁力攪拌器旋轉。

圖2、水培養瓶用18O2標記。標記的水以0.73 mL min-1的流量泵出瓶子的薄膜入口穿過(guò)質(zhì)譜儀。水是通過(guò)一個(gè)氣密袋中脫去無(wú)標記氧的水后定位在上邊緣的壓力進(jìn)入取而代之。氦氣作為載體氣體，具有質(zhì)量穩定、速度快的特點(diǎn)。

圖3、實(shí)驗1:光學(xué)氧傳感器和全量程光學(xué)氧傳感器(全范圍)和STOX傳感器測試體系中的氧濃度的示意圖。脫氣水依次富集，通過(guò)加入已知體積的飽和空氣水(箭頭)來(lái)補充氧氣。消耗率計算后，增加的O2隨時(shí)間減少。30小時(shí)后加入ZnCl2停止生物活性。插圖表示的是在最初幾個(gè)小時(shí)內的光電子初始適應情況。

圖4、對比幾種測試方法氧氣隨時(shí)間的變化情況。實(shí)驗結束后用光電子和STOX傳感器測量氧氣消耗速率，調節O2濃度為1.2 umol L-1(A)、5.5 umol L-1(B)、umol L-1(C)，加入20ml ZnCl2后圖(D)，線(xiàn)性擬合用直線(xiàn)表示。其中時(shí)間和濃度軸的縱橫比(umol L-1 h-1)對于所有允許的圖形都是相同的坡度上進(jìn)行比較的。

圖5、比較膜入口質(zhì)譜法（MIMS）和安培電流法（STOX）傳感器（unisense氧微電極）。O2的濃度和消耗率測量后，添加1.2 umol 18-18O2 L-1(圖A箭頭所示.單個(gè)MIMS法的測量值(灰色點(diǎn))取平均值(黑點(diǎn))，并用相應的點(diǎn)表示標準差。整個(gè)實(shí)驗運行3小時(shí)同時(shí)測量。(B)用于氧的消耗速率計算。

表1、三種不同方式測量的氧的耗速率、方法設置和統計。表1中總結了不同O2濃度(O2)、不同傳感器和采樣頻率下測量的O2消耗耗率。由式(1)和式(2)計算各速率測量值、標準差(SE)和殘差均方根(RMSRES)及潛在的檢出率極限，假設培養24小時(shí)由公式3計算。請注意較低的RMSRES表示較高的精度和潛在的速率檢測限制只基于精度和測量頻率，而不考慮傳感器漂移或O2污染帶來(lái)的可能限制。

圖6、耗氧速率與O2濃度的關(guān)系。實(shí)驗1、實(shí)驗2、實(shí)驗3的耗氧量被總結并繪制在各自孵育的初始O2濃度上。實(shí)驗3中的虛線(xiàn)表示由公式4估算出的擴散極限速率，假設總直徑(r0)為0.14 mm。其中實(shí)驗1的獲得的氧消耗速率也隨著(zhù)培養時(shí)間的增加而增加，同時(shí)也能反映細菌隨時(shí)間的增長(cháng)。

表2、不同測試方法在精度、檢出限和適用性方面進(jìn)行比較圖。表中的評級方案采用符號表示:正常(+)、強(++)和非常強(+++)。同時(shí)比較了傳感器的易損性、現場(chǎng)操作性和易損件的價(jià)格對比情況。

總結

由于深海屬于的微生物的氧呼吸具有重要的生態(tài)學(xué)意義，因此研究人員需要找到一種測試方法能夠準確的測試出深海水域的微生物的呼吸速率，由于微生物的氧呼吸的濃度特別低，因此需要具有高分辨率的氧濃度測試設備，并且其檢測限能夠達到nmol/L，這對于設備的要求非常高，而丹麥unisense公司開(kāi)發(fā)的氧微電極能夠很好的完成這些測試，研究人員為了能夠獲得海水中微生物的氧的消耗速率的準確性，同步使用了光學(xué)氧傳感器以及質(zhì)譜法來(lái)同步驗證，對于連續測量和極低的氧消耗速率，推薦使用STOX傳感器（unisense微電極）和光學(xué)氧傳感器，而相比于光學(xué)氧傳感器，STOX傳感器的使用成本較低，非常適合研究人員應用與微生物的氧消耗測試，并且相比于其他方法，也具有較高的精度，尤其是在低氧濃度下培養的微生物的呼吸速率的測試，因為這些微生物的聚集體的存在是存在一定的擴散速率，需要考慮的擴散限制氧氣消耗情況，而unisense微電極具有測試速度響應快、受氧氣擴散消耗的影響小等優(yōu)點(diǎn)，可以在原位條件實(shí)現對微生物的氧呼吸速率的測試，這也說(shuō)明unisense微電極在低氧濃度的海洋環(huán)境中的水生生物的呼吸速率的測試具有非常好的應用前景。