背景介紹：研究表明細胞在培養和組織中也可能對更為溫和缺氧環(huán)境作出反應，通過(guò)復雜的基因調控反應也包括選擇性激活，而這些基因大多數受到缺氧反應因子的影響。在細胞培養實(shí)驗中控制細胞外圍的氧分壓通常是通過(guò)修復細胞培養上方的氣相介質(zhì)中的氧分壓，然而細胞外圍的氧分壓還取決于培養基是否攪拌，細胞的數量和他們的代謝率在一個(gè)特定培養環(huán)境中以及擴散介質(zhì)表面到瓶底的距離，本論文的的研究人員采用了一種新的檢測的手段（unisense）實(shí)現了對細胞周?chē)鯊埩z測，以及對個(gè)別細胞集落的局部效應的氧分壓的監測成為可能。


Unisense微電極系統的應用


應用了克拉克型的Unisense氧氣微電極（尖端直徑為10um）測試了培養基環(huán)境中的細胞周?chē)难醴謮?，其中所研究的培養物放置在人工操作的顯微鏡上并置于培養箱內。所有的測量都在培養箱內進(jìn)行，氧微電極以30度角度插入到培養基環(huán)境中對細胞周?chē)难醴謮哼M(jìn)行測試。


實(shí)驗結果


研究表明盡管暴露于環(huán)境空氣的氧分壓下，傳統的貼壁細胞在進(jìn)行培養時(shí)可能會(huì )經(jīng)歷細胞周?chē)醴謮旱陀诰S持充分氧化代謝所需的水平。當細胞進(jìn)行培養時(shí)，消耗氧的報告的更明顯，細胞培養是在氧分壓降低的情況下培養的(降低到4%左右的氧)。研究結果說(shuō)明，如果不測量培養細胞周?chē)难醴謮?，是不可能的與體外培養結果聯(lián)系起來(lái)的(例如基因表達與氧分壓有關(guān)細胞所表達的)，而這一濃度可能會(huì )大大偏離記錄在氣相中的氧濃度。

圖1、在培養箱內測量氧分壓的裝置顯示。氧微電極傳感器安裝在倒置的奧林巴斯CK41顯微鏡上，微電極使用了微操作控制臺進(jìn)行控制。

圖2、研究了氧微電極傳感器在皮安表中對應的線(xiàn)性響應隨傳感器尖端周?chē)醴謮旱淖兓幝?

圖3、常規培養的T-47D細胞對應的氧分壓曲線(xiàn)(即氧分壓與瓶底以上高度距離的函數圖)。在第0天，每個(gè)燒瓶接種5×106或102個(gè)細胞，培養的細胞環(huán)境中為含5%二氧化碳的大氣。圖中的符號○□△◇分別代表的是1-、2-、3-和培養4天的培養基中的氧濃度剖面圖，每瓶對應的是0.5×106個(gè)細胞，第0天接種時(shí)，所有這些剖面圖都表示的是測量的尖端直接落在菌落的頂部的測量值。然而，對于3天和4天的細胞培養物，獲得的數據是微電極的測量尖端與菌落之間的結束位置。如(b)所示,分別培養4天和7天，每個(gè)燒瓶接種106個(gè)細胞。

圖4、第7天培養T-47D細胞。每個(gè)燒瓶接種106個(gè)細胞，在含氧濃度為19%的體系中生長(cháng)。

圖5、表面底部氧分壓差值對應5×105細胞/培養皿接種時(shí)間的函數圖。第7天培養時(shí)，細胞周?chē)难醴謮旱陀谌毖鹾粑?1.3%)。開(kāi)放的圓圈表示細胞在含4%氧氣的環(huán)境中生長(cháng)，封閉的圓圈表示含19%氧氣的環(huán)境中生長(cháng)。


總結


細胞正常培養的過(guò)程中，盡管可通過(guò)在氣相中環(huán)境中控制培養環(huán)境中高而恒定的氧氣濃度，但是細胞周?chē)难醴謮旱臅?huì )隨著(zhù)培養的進(jìn)行會(huì )急劇的降低，因此每個(gè)細胞耗氧量由培養基中氧分壓曲線(xiàn)計算獲得的。研究人員發(fā)現某些哺乳動(dòng)物細胞培養中生長(cháng)時(shí)，氧分壓程度存在重要差異。氧在細胞培養基中的擴散速率較低，由于正常的呼吸作用，氧分壓的降低通常在細胞附近發(fā)生。因此為了標準化和優(yōu)化，監測細胞周?chē)难醴謮汉图毎暮难趿糠浅Ｖ匾?


研究人員首次應用了丹麥unisense公司集成的氧微電極系統，該套系統（unisense微剖面分析系統）使用的是克拉克型的微電極與皮安表結合使用，在顯微鏡的配合下可實(shí)現對細胞周?chē)难鯘舛确謮旱脑诰€(xiàn)監測，由于使用的電極的尖端非常細（5um-500um之間，）可進(jìn)入穿刺入到覆蓋細胞培養層處1.6毫米深的介質(zhì)層區域測試垂直橫斷面區域的氧濃度剖面，獲得相關(guān)的氧濃度剖面數據對于研究人員分析細胞培養過(guò)程中的耗氧提供了重要的數據支持，為研究人員在相應的細胞或組織培養方案中提供重要的理論指導，這說(shuō)明unisense這套剖面分析系統在細胞培養等領(lǐng)域存在很好的應用前景。