背景介紹：組織工程技術(shù)的最新進(jìn)展使研究人員能夠開(kāi)發(fā)厚層組織結構，然后將其移植應用到再生治療中去。然而目前臨床應用上，至關(guān)重要的是所植入的工程化組織在使用前是安全和功能化的。但是目前對厚層組織構建的實(shí)時(shí)質(zhì)量評價(jià)的研究是有限的。本論文研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)關(guān)于工程組織活性進(jìn)行定量化的系統，用于實(shí)時(shí)評估組織的相關(guān)性能。研究人員在對工程組織活性的評估是通過(guò)測量沿垂直軸方向的氧濃度以及應用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來(lái)判斷工程組織的厚度，并應用氧微電極技術(shù)獲得的培養的組織細胞的氧濃度，獲取關(guān)于與工程組織性能相關(guān)的三個(gè)重要的參數，并得出了一種關(guān)于生物工程組織的活性可以通過(guò)測量組織內部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監測的方法。

Unisense微電極系統的應用

使用尖端直徑為10微米的克拉克型氧微電極結合三維操作器測試了培養皿中層狀細胞目標區域中的氧濃度，氧微電極是先直接插入培養皿表面的層狀細胞層中直至微電極尖端恰好接觸到培養皿底部后，然后使用自動(dòng)三維操作器控制微電極向上移動(dòng)10um并等待10分鐘，然后沿垂直軸方向測試培養皿中的溶解氧分布，其中微電極的每次測試間隔距離為為40毫米，直到微電極尖端從培養皿表面的培養基中露出來(lái)為止。

實(shí)驗結果

本論文研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)關(guān)于工程組織活性進(jìn)行定量化的系統，從中實(shí)時(shí)評估工程組織的性能。工程組織活性的評估過(guò)程通過(guò)測量沿垂直軸方向的氧濃度以及應用光學(xué)相干斷層掃描（OCT）獲得工程組織的橫斷面圖像來(lái)判斷工程組織的厚度。得到了工程組織上方的氧濃度，培養基質(zhì)中和工程組織上方區域的垂直軸上形成的氧梯度、組織內部實(shí)時(shí)形成的氧梯度。其中組織內部實(shí)時(shí)形成的氧梯度這個(gè)參數用于評價(jià)培養過(guò)程中工程組織的性能。這說(shuō)明生物工程組織的活性可以通過(guò)測量組織內部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監測。所提出的測量策略可應用于開(kāi)發(fā)更有效的組織培養方法，并支持了厚工程組織的培養提供了實(shí)時(shí)確認定量的依據。

圖1、研究流程示意圖。圖(A)表示的是單個(gè)測試實(shí)驗的時(shí)間安排表。圖(B)表示的是應用氧微電極測試培養的層狀細胞氧濃度剖面的測試方法。(C)測試一定厚度的含層狀細胞的氧剖面濃度確定的定三種參數:POC(樣品中細胞周?chē)难鯘舛?、gradOxmedium(樣品中培養基中的氧梯度)gradOxytissuess(樣品中細胞組織的氧梯度)。圖(D)表示的是光學(xué)相干斷層掃描（OCT）系統獲得的橫斷層面截流動(dòng)影像圖。

圖2、在正常培養皿中培養的細胞組織樣本在一次實(shí)驗中獲得的一個(gè)示例實(shí)驗數據集。并給出了在第0天(圖A所示)，第1天(圖B所示)和第5天(圖C所示)培養周期的三層的成肌細胞樣本測試數據。左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布。其中圖中顯示的氧氣濃度值的是與培養基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。一條垂直線(xiàn)表示的是層狀細胞和培養基之間的邊界。樣品組織的平均厚度就是顯示在這條線(xiàn)附近區域。圓括號中的數值表示層狀細胞內的氧濃度與培養基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。右邊的圖顯示的是重組的組織樣本中心區域的3d圖像的側面和頂部視圖，應用的是OCT系統獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現出來(lái)。

圖3、在0-5天的培養過(guò)程中測量的細胞組織樣品厚度、細胞培養時(shí)間、細胞周?chē)鯘舛龋≒OCs）之間的相關(guān)性實(shí)驗。其中圖(A)在正常培養皿上進(jìn)行細胞培養；圖(B)在細胞培養池進(jìn)行培養。其中圖中的第0天、第1天和第5天獲得的數據分別采用三角形、正方形及×形表示以便區分。

圖4、在單個(gè)實(shí)驗中使用細胞池培養的樣本獲得的數據。本論文中的實(shí)驗數據案例是在(A)第0天、(B)第1天和(C)第5天的三層成肌細胞樣本中獲得的數據。其中左邊左邊的圖表示的是氧的剖面濃度分布，右邊的圖表示的是采用了OCT系統獲得的橫斷層面影像圖。其中不同的空隙率值采用了不同的顏色表現出來(lái)。圓括號中的數值表示層狀細胞內的氧濃度與培養基與空氣界面處的氧濃度（Csat）的比值。

圖5、提出用葡萄糖消耗率來(lái)評價(jià)層狀細胞的活力指數。其中圖(A-C)表示的是培養單、雙、三層的細胞組織所需的葡萄糖消耗速率。其中的細胞組織的培養是正常的培養皿(●)或細胞池(□)上培養。圖中的所獲得的實(shí)驗點(diǎn)是根據測量所用的時(shí)間間隔繪制的。圖(D-F)表示的△GCR指數定義為DGCRDay 4-5-GCR Day 0-1]/GCR Day0-1，其中的獲取的數據是分別從單層、雙層和三層細胞組織中獲得的，橫坐標表的是在正常的培養皿中和在細胞池中進(jìn)行培養的方法。

結論與展望

為了恢復受損組織和器官的功能，研究人員首次提出關(guān)于將功能細胞移植到受損組織中的技術(shù)方案。移植細胞被認為可以分泌細胞因子和趨化因子，從而誘導血管生成抗纖維化，抗凋亡，并將干細胞植入受損組織。隨著(zhù)研究人員對厚組織的臨床應用研究的不斷深入，厚組織的臨床應用也越來(lái)越多重要，但是移植的厚結構組織在使用前需要了解其是否安全有效，目前對于這一類(lèi)的研究報道較少。本論文研究人員開(kāi)發(fā)一種實(shí)時(shí)測量氧濃度的系統方法，研究人員在評價(jià)組織的性能時(shí)采用了unisense公司生產(chǎn)的克拉克型氧氣微電極，該微電極可以實(shí)現對于組織細胞培養環(huán)境中關(guān)于細胞組織上方的氧濃度、培養基質(zhì)中和工程細胞組織上方區域的垂直軸上形成的氧梯度以及細胞組織內部實(shí)時(shí)形成的氧梯度測試。獲取的這三個(gè)重要的氧濃度參數對于判斷工程細胞組織的活性及組織的功能化的非常重要，這也意味著(zhù)生物工程組織的活性是可以通過(guò)測量組織內部的氧梯度來(lái)實(shí)時(shí)監測完成的。這種測量策略的提出為今后的在厚工程組織的培養提供了實(shí)時(shí)確認定量的方法。這也另一個(gè)側面說(shuō)明了丹麥Unisense公司開(kāi)發(fā)的克拉克型氧微電極在移植細胞培養工程學(xué)領(lǐng)域方面存在非常好的應用前景。