2.2溫度對Anammox-DAMO系統N2O產(chǎn)消過(guò)程中EPS的影響

2.2.1溫度對Anammox-DAMO系統EPS變化的影響EPS是一種高分子量聚合物，主要由多糖（PS）和蛋白質(zhì)（PN）組成，可用作保護層，以減弱惡劣環(huán)境對微生物的脅迫。此外，EPS在微生物的生物膜形成??；头€定性中起重要作用。由圖5可知，兩個(gè)系統中PN含量的變化占主導地位，PS含量整體變化幅度并不明顯，PN含量隨著(zhù)時(shí)間的推移先升高后降低，這是由于該體系在試驗前期需要通過(guò)增加PN含量來(lái)維持穩定性。與R1系統不同，在R2系統中，PN含量在中、后期都較初期有更大的增加幅度。

圖5 Anammox-DAMO系統中EPS含量變化

總體而言，R2系統在中后期PN和PS的含量都高于R1系統，隨著(zhù)溫度的增加，蛋白質(zhì)和多糖溶解并從污泥中釋放出來(lái)。R2系統中PN的量要比R1系統顯著(zhù)高很多（P<0.05），這是由于高溫脅迫下導致R2系統產(chǎn)生更多的PN以適應環(huán)境條件。在整個(gè)過(guò)程中，各組PN均高于PS,這與其他研究相似0,4.結果表明，R2系統中期的EPS與初期對比起來(lái)有所增加，PS含量穩定在4.9mg/L,PN含量由6.6增加到11.3mg/L,可見(jiàn)，相較于PS,高溫沖擊對PN的影響程度更大，這主要歸因于微生物對惡劣環(huán)境的自我保護機制。作為影響細胞表面電荷和疏水性的一個(gè)因素，較高的PN提高了Anammox-DAMO系統中微生物的粘附性，并減輕了溫度沖擊對Anammox-DAMO系統微生物的損傷。

R2系統在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的EPS,導致N2O擴散進(jìn)入細胞內部的傳質(zhì)阻力增加，N2O還原酶的作用時(shí)間縮短使得N2O排放量升高，這與Sabba等的研究結果一致。

2.2.2溫度對Anammox-DAMO系統可溶性蛋白影響圖6（a）和6（b）為初期（0d）的三維熒光圖，發(fā)現發(fā)射峰位于300——350nm處，激發(fā)峰位于250——300nm處，通過(guò)與其他研究中熒光組分的激發(fā)和發(fā)射最大值位置進(jìn)行比較，該范圍內顯示熒光激發(fā)峰的物質(zhì)為蛋白質(zhì)5-4,其中激發(fā)峰在250——340nm,發(fā)射峰在280——380nm處主要包含物為酪氨酸和色氨酸。激發(fā)峰在220——340nm,發(fā)射峰在380——520nm處主要包含物為腐殖酸7-5.根據實(shí)驗結果可知初期實(shí)驗測得的主要物質(zhì)是酪氨酸/色氨酸。

圖6溫度對Anammox-DAMO系統可溶性蛋白影響

從圖6（c）中可知，R1系統三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于250——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（d）顯示R2系統三維熒光發(fā)射峰位于300——450nm處，激發(fā)峰位于200——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸、微生物代謝物、多糖以及富里酸。由圖中可得出EPS中蛋白質(zhì)的熒光強度明顯大于多糖?腐殖酸，說(shuō)明系統中微生物更多的產(chǎn)生蛋白質(zhì)來(lái)適應溫度變化對其影響。且R2系統中期的熒光信號要明顯強于初期，并且強于同時(shí)期的R1系統的熒光信號，表明高溫會(huì )對反應器中的微生物活動(dòng)產(chǎn)生影響，從而干擾有機物的分泌，產(chǎn)生更多的酪氨酸/色氨酸。有研究表明色氨酸類(lèi)和酪氨酸類(lèi)蛋白質(zhì)物質(zhì)與N2O的排放量呈顯著(zhù)正相關(guān)關(guān)系1-5,因此R2系統中更高的N2O產(chǎn)生量可歸因于更多酪氨酸/色氨酸的生成。

從圖6（e）可知R1系統三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于200——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物以及多糖。圖6（f）顯示R2系統三維熒光發(fā)射峰位于300——400nm處，激發(fā)峰位于250——350nm處，主要物質(zhì)為酪氨酸/色氨酸?微生物代謝物?多糖。R2系統末期的熒光信號與中期相比逐漸減弱，逐漸恢復到初期水平，并與R1系統的熒光信號無(wú)顯著(zhù)性差異，表明R2中的微生物逐漸適應高溫環(huán)境，這與系統性能的惡化與恢復趨勢一致。

2.3溫度影響下Anammox-DAMO系統N2O產(chǎn)消的生物學(xué)機制

2.3.1溫度對Anammox-DAMO系統微生物群落變化的影響如圖7（a）所示，R1和R2的優(yōu)勢菌門(mén)均為Proteobacteria,且分別占比33%和40%,它是厭氧氨氧化系統常見(jiàn)的一大門(mén)類(lèi)，且有研究表明Proteobacteria大多數是反硝化細菌，并且Proteobacteria中的大部分菌可以參與甲烷氧化過(guò)程，普遍存在于污水處理廠(chǎng)脫氮除磷工藝中。第二優(yōu)勢菌門(mén)是Chloroflexi,分別占比14%和17%,它的作用是在細胞生長(cháng)過(guò)程中降解有機分子或分泌可溶性化合物。在溫度的影響下，R2系統中的Firmicutes、Chloroflexi、Bacteroidetes和Euryarchaeota等嗜熱微生物豐度上升。相反在高溫脅迫下Actinobacteria和Ignavibacteriae的豐度相比R1有所下降，說(shuō)明高溫環(huán)境不利于其生存。

圖7微生物相對豐度分布

圖7（b）顯示2個(gè)系統中均發(fā)現了芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonad）、食酸菌屬（Acidovorax）、陶厄氏菌屬（Thauera）、甲基單胞菌屬（Methylomonas）、Methanoperedens nitroreducens、叢毛單胞菌屬（Comamonadaceae）、特呂珀菌屬（Truepera）、Kuenenia、甲烷微菌屬（Methylomicrobium）。Acidovorax是常見(jiàn)的反硝化菌，Thauera是自養型反硝化細菌4-5,相比于R1系統，這兩種菌屬豐度在R2系統中均有所下降，表明高溫環(huán)境會(huì )抑制其生長(cháng)。Tanikawa等認為Acidovorax和Thauera是反硝化過(guò)程中主要的N2O還原劑，Zhao等在Thauera中檢測到了大部分N2O還原酶編碼基因，證明了Thauera在N2O還原過(guò)程中的巨大貢獻，R2系統中Thauera豐度的下降是N2O積累量更多的原因。另外，有研究證明Bacillus可能在N2O排放方面發(fā)揮巨大作用，本文在R2系統中檢測到了該屬更高的豐度，這也是導致N2O排放量更高的重要原因。Methylomonas中存在亞硝酸鹽還原酶，其在R2系統中的豐度明顯低于R1系統，導致R2系統亞硝酸鹽大量積累。Methanoperedens nitroreducens已知為進(jìn)行硝酸鹽驅動(dòng)的厭氧甲烷氧化的n-DAMO古菌，在R1系統中的占比為23.22%,在R2系統中的占比為16.40%,由此可見(jiàn)高溫抑制了DAMO古菌的生長(cháng)，造成脫氮速率下降。Ca.Kuenenia和Ca.Brocadia與脫氮直接相關(guān)，是常見(jiàn)的Anammox細菌，在R1系統中兩者的占比分別為17.64%和12.47%,在R2系統中兩者的占比分別為19.01%和16.65%,可以看出Anammox兩個(gè)菌屬在R2中占比升高。這可能是因為DNRA反應產(chǎn)生的銨促進(jìn)了Anammox微生物的生長(cháng)。在兩個(gè)系統中均未檢測到能夠進(jìn)行DNRA反應的典型微生物，因此推測DAMO古菌利用甲烷厭氧氧化產(chǎn)生的電子發(fā)生了DNRA反應。

2.3.2溫度對Anammox-DAMO系統微生物功能基因豐度變化影響反硝化過(guò)程主要由4種酶催化，即硝酸鹽還原酶（narGHI/napAB）、亞硝酸鹽還原酶（nirK/nirS）、NO還原酶（norBC）和N2O還原酶（nosZ）。nrfA是DNRA的分子標志物，由圖8可見(jiàn)，其在R2系統中相對豐度較高，對高溫條件表現出明顯的偏好性，Lai等將溫度從10℃提升到40℃時(shí)，nrfA基因豐度增加，DNRA反應過(guò)程增強，說(shuō)明DNRA反應與nrfA基因豐度呈顯著(zhù)正相關(guān)。對于硝酸還原酶基因，相較于R1系統，R2系統中的napAB轉錄明顯上調，顯示了對DNRA的主要貢獻（硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽），然而narGHI的表達水平與R1系統幾乎一致，表明對部分DNRA的貢獻較小。對于亞硝酸還原酶基因，nirSK在R2系統中的相對豐度低于R1系統，減弱了R2系統對亞硝酸鹽還原能力進(jìn)而導致亞硝酸鹽積累，這主要歸因于高溫會(huì )顯著(zhù)降低nirK基因的豐度。另外，在R2系統中，NO還原酶基因（norB）相對豐度更高，而N2O還原酶基因（nosZ）相對豐度較低，說(shuō)明高溫條件抑制了nosZ酶的生成，進(jìn)而阻礙了N2O被還原。hdh和hzs是參與Anammox反應的酶，其中hzs在R2中的相對豐度高于R1系統，且與nrfA的變化呈正相關(guān)關(guān)系，表明DNRA反應產(chǎn)生的銨為Anammox提供了底物，從而促進(jìn)Anammox過(guò)程的發(fā)生。

圖8不同溫度下氮代謝和碳代謝功能基因豐度

在R2系統中，Anammox基因豐度高，但脫氮性能卻比R1差。這種現象可以通過(guò)不利的溫度和FNA對轉錄、翻譯和酶活性的抑制來(lái)解釋。以亞硝酸鹽還原酶與N2O還原酶的比值（Σnir/nos）作為N2O產(chǎn)生潛力的指標，其中Σnir/nos是由nir基因（nirS+nirK）之和除以nos基因測定的。結果表明R2系統中Σnir/nosZ（1.95）高于R1系統（1.49），說(shuō)明Anammox-DAMO系統在高溫脅迫下更易積累N2O.

2.4溫度影響下Anammox-DAMO系統動(dòng)力學(xué)機制及N2O減排調控策略

2.4.1溫度影響下Anammox-DAMO系統動(dòng)力學(xué)機制如圖9及表1、2、3所示，NO3-、NH4+和N2O酶動(dòng)力學(xué)方程中Vmax均隨著(zhù)溫度的升高先增大后減小，在35℃時(shí)最大，40℃時(shí)最小，意味著(zhù)硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶均在35℃時(shí)擁有最大比合成/活化速率，酶活性最強。KI,R為對應還原酶的抑制系數，3種酶動(dòng)力學(xué)方程的KI,R隨溫度的升高先降低后升高，同樣在35℃時(shí)最大，40℃時(shí)最小，表明35℃的溫度條件對3種酶的抑制作用最小。3種酶動(dòng)力學(xué)方程的半飽和常數KE,i隨著(zhù)溫度的升高先減少后增加，在35℃時(shí)最小，40℃時(shí)最大。

表1不同溫度下NO3-降解酶動(dòng)力學(xué)參數

表2不同溫度下NH4+降解酶動(dòng)力學(xué)參數

表3不同溫度下N2O消耗酶動(dòng)力學(xué)參數

圖9酶動(dòng)力學(xué)擬合曲線(xiàn)

硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、N2O還原酶的活性均隨著(zhù)溫度的升高呈現先增強后減弱的趨勢，且在35℃時(shí)活性達到最大，意味著(zhù)在此溫度下Anammox-DAMO系統的脫氮性能最好，N2O還原效果最好，能夠實(shí)現最大程度減少N2O排放量。低于或高于35℃的溫度條件都會(huì )對酶的活性產(chǎn)生不利影響，造成系統性能的惡化以及N2O的積累，擬合結果印證了短期試驗結果。Hu等利用實(shí)驗室規模的缺氧/好氧間歇式反應器探究了溫度對N2O排放的影響，結果表明在10——35℃的溫度條件下，N2O排放量隨溫度的升高而降低，該系統主要是通過(guò)溫度變化影響硝化和反硝化的總體過(guò)程速率來(lái)影響N2O的排放，本研究在該溫度范圍的基礎上繼續擴大溫度范圍，發(fā)現在20——40℃的范圍內，系統在35℃時(shí)出現N2O排放低谷。此外，Qian等在TDD-Anammox耦合工藝中發(fā)現35℃時(shí)系統N2O排放量最少，這主要歸因于A(yíng)nammox微生物（其特征是不產(chǎn)生N2O）在此溫度下發(fā)揮最大作用，而本研究酶動(dòng)力學(xué)擬合結果證明了參與Anammox過(guò)程的亞硝酸鹽還原酶在35℃下活性最大，與其實(shí)驗結果相符。

綜上所述，動(dòng)力學(xué)模型可以很好地預測系統在不同溫度下N2O排放情況，根據酶動(dòng)力學(xué)擬合結果推測出N2O排放量最少的溫度條件為35℃，在此溫度下該系統可以最大程度地實(shí)現N2O減排。

2.4.2 Anammox-DAMO系統代謝途徑及N2O調控策略根據檢測到的功能菌和基因，通過(guò)比對KEGG數據庫的注釋對溫度影響下Anammox-DAMO系統特殊氮代謝途徑進(jìn)行分析（圖10）。

圖10 Anammox-DAMO系統特殊氮代謝途徑

在A(yíng)nammox-DAMO系統中，除已被證實(shí)的Anammox-DAMO氮代謝基因，還檢測到了與DNRA反應相關(guān)的nrfA基因，且在高溫脅迫下其豐度顯著(zhù)增加。研究表明DAMO古菌有編碼nrfA的基因，因此具有發(fā)生DNRA反應的潛力。高溫抑制了Anammox-DAMO系統中nir酶的活性，造成亞硝酸鹽積累，基于nrfA的解毒機制，此時(shí)nrfA會(huì )將NO2-還原為NO,nrfA與活性位點(diǎn)血紅素c基團A結合的晶體結構將NO轉化為N2O.在本研究中還檢測到了與N2O產(chǎn)消相關(guān)的norB、norC和nosZ基因。有研究表明，Anammox細菌會(huì )生成中間產(chǎn)物NO,norB和norC基因可能會(huì )對外部亞硝化應激做出快速反應，為了將NO維持在毒性水平以下會(huì )把NO轉化為N2O.高溫影響下，Anammox細菌產(chǎn)生的NO促進(jìn)了norBC基因豐度增加，進(jìn)而將更多的NO轉化為N2O.與此同時(shí)，Anammox-DAMO系統中的nosZ基因豐度降低，說(shuō)明高溫抑制了N2O還原酶的生成，導致無(wú)法及時(shí)將產(chǎn)生的N2O還原，造成N2O凈排放量升高。綜上所述，N2O產(chǎn)生和消耗途徑可作如下解釋?zhuān)篈nammox-DAMO系統中檢測到的N2O由DNRA反應及Anammox細菌對NO解毒作用產(chǎn)生，而N2O的消耗大部分由編碼nosZ基因的微生物完成。

基于A(yíng)nammox-DAMO系統中N2O特殊的產(chǎn)消代謝途徑，本研究發(fā)現高濃度亞硝酸鹽脅迫是導致Anammox-DAMO系統N2O積累的主要原因。高溫通過(guò)影響系統氮代謝過(guò)程中的關(guān)鍵功能基因酶的活性，導致亞硝酸鹽濃度升高，進(jìn)而觸發(fā)DNRA反應及Anammox細菌的解毒作用。反硝化過(guò)程中4個(gè)還原步驟之間的電子競爭以及不同還原酶的活性決定了N2O的積累程度，本研究中，對系統性能不利的高溫條件會(huì )顯著(zhù)降低N2O還原酶的活性，導致N2O的凈排放量升高。因此，盡可能控制系統在運行過(guò)程中維持在中溫條件，豐富具有較強N2O還原能力的微生物群，可以促進(jìn)N2O的還原。在后續研究中，還需要優(yōu)化pH值、C/N、DO、FNA等其他操作條件，避免運行過(guò)程中亞硝酸鹽的積累，并研究不同操作條件下N2O還原酶的活性，以最大限度地減少廢水處理中N2O的產(chǎn)生。

3結論

3.1高溫顯著(zhù)降低了Anammox-DAMO系統的脫氮性能，且在高溫脅迫下系統中亞硝酸鹽積累進(jìn)而導致N2O的凈排放量升高，根據甲烷與硝酸鹽降解速率比值可知該系統在長(cháng)期運行過(guò)程中還存在DNRA反應。

3.2 Anammox-DAMO系統中微生物在高溫脅迫下產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)以緩解惡劣環(huán)境造成的損傷，三維熒光光譜結果顯示其主要為色氨酸類(lèi)和酪氨酸類(lèi)蛋白質(zhì)物質(zhì)，該類(lèi)物質(zhì)的分泌與N2O的排放量呈顯著(zhù)正相關(guān)。

3.3高通量測序結果表明，在高溫影響下系統中與N2O還原相關(guān)的Acidovorax和Thauera屬豐度降低，而與N2O產(chǎn)生相關(guān)的Bacillus屬豐度則上升。宏基因測序結果表明高溫降低了nirSK豐度，造成亞硝酸鹽積累，此外在高溫條件下norB豐度增加而nosZ豐度減少，加速了N2O生成的同時(shí)抑制了其還原，導致N2O積累。

3.4在不同溫度下對Anammox-DAMO系統進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)擬合，發(fā)現低溫和高溫均會(huì )增加N2O的凈排放量，而在35℃時(shí)可以最大程度地實(shí)現N2O減排。