研究簡(jiǎn)介:介紹了一種新型的非侵入式、高靈敏度微傳感器系統，用于測量牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率，并探討其與胚胎形態(tài)、直徑、性別及發(fā)育階段的相關(guān)性。傳統胚胎質(zhì)量評估主要依賴(lài)形態(tài)學(xué)評價(jià)，但這種方法主觀(guān)性強且難以準確判斷中等質(zhì)量胚胎的發(fā)育潛力。因此本研究旨在開(kāi)發(fā)一種更客觀(guān)、準確的胚胎質(zhì)量評估方法。研究使用了第3天的8細胞期胚胎和第7天的囊胚期胚胎，通過(guò)新型微傳感器系統測量其呼吸速率。該系統基于微型氧氣傳感器，通過(guò)檢測胚胎在玻璃毛細管中產(chǎn)生的線(xiàn)性穩態(tài)氧氣梯度來(lái)計算呼吸速率。實(shí)驗結果表明，第7天囊胚的平均呼吸速率顯著(zhù)高于第3天胚胎，且呼吸速率與胚胎直徑呈正相關(guān)。此外第7天囊胚的呼吸速率與其質(zhì)量等級相關(guān)，質(zhì)量等級為1的囊胚呼吸速率最高，而不同性別的胚胎呼吸速率無(wú)顯著(zhù)差異。本研究提供了一種快速、準確且非侵入式的胚胎呼吸速率測量方法，能夠在短時(shí)間內完成單個(gè)胚胎的代謝活動(dòng)評估。呼吸速率作為一種客觀(guān)的代謝指標，與胚胎形態(tài)學(xué)評估相結合，有望進(jìn)一步提高胚胎分類(lèi)和選擇的準確性，從而為胚胎移植的成功率提供更可靠的預測依據。未來(lái)的研究將進(jìn)一步驗證呼吸速率在胚胎發(fā)育潛能評估中的應用價(jià)值，并探索其在動(dòng)物胚胎生產(chǎn)和人類(lèi)輔助生殖技術(shù)中的潛在應用。

Unisense超微呼吸極系統的應用

Unisense超呼吸測量系統發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，它為研究者提供了一種高靈敏度、非侵入式且快速準確的手段來(lái)測量牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率。Unisense超系統的核心是一個(gè)微型氧氣傳感器（OX50），其尖端直徑僅為40–60μm。這種微型化設計使得傳感器能夠精確地測量微小空間內的氧氣濃度變化。傳感器的響應時(shí)間小于5秒，且自身氧氣消耗可以忽略不計，這確保了測量結果的高精度和可靠性。Unisense系統通過(guò)將胚胎放置在玻璃毛細管底部，利用傳感器測量毛細管內的氧氣濃度梯度，從而實(shí)現了非侵入式測量。這種方法不會(huì )對胚胎造成損傷，也不會(huì )干擾胚胎的正常發(fā)育。在短時(shí)間內完成對單個(gè)胚胎的呼吸速率測量。在本研究中，每個(gè)胚胎的測量過(guò)程僅需約8分鐘，這使得研究者能夠在短時(shí)間內對大量胚胎進(jìn)行測量。此外本系統的設計允許同時(shí)測量多個(gè)胚胎，進(jìn)一步提高了實(shí)驗效率。

實(shí)驗結果

驗證了一種新型高分辨率微電極技術(shù)，用于測定不同發(fā)育階段單個(gè)胚胎的呼吸速率。我們利用該技術(shù)研究了呼吸速率與胚胎形態(tài)、直徑和性別之間的相關(guān)性。研究表明，第7天的囊胚期胚胎的平均呼吸速率（1.30±0.064 nl/h）顯著(zhù)高于第3天的8細胞期胚胎（0.38±0.011 nl/h），表明隨著(zhù)胚胎發(fā)育，其代謝活動(dòng)顯著(zhù)增強。這種差異反映了胚胎在不同發(fā)育階段的能量需求變化。對于第7天的囊胚，質(zhì)量等級為1的胚胎呼吸速率顯著(zhù)高于其他質(zhì)量等級的胚胎。具體而言，質(zhì)量等級為1的胚胎呼吸速率為1.72±0.18 nl/h，而質(zhì)量等級為2、3和4的胚胎呼吸速率分別為1.23±0.14 nl/h、1.07±0.14 nl/h和0.81±0.22 nl/h。這表明呼吸速率與胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)，高質(zhì)量胚胎通常具有更高的呼吸速率。胚胎的呼吸速率與其直徑直接相關(guān)，直徑較大的胚胎具有更高的呼吸速率。這種關(guān)系可能與胚胎的代謝需求和能量消耗有關(guān)，較大的胚胎需要更多的氧氣來(lái)維持其代謝活動(dòng)。在第3天和第7天的胚胎中，呼吸速率在不同性別的胚胎之間沒(méi)有顯著(zhù)差異。這表明性別對胚胎的呼吸速率影響較小，呼吸速率主要與胚胎的發(fā)育階段和質(zhì)量相關(guān)。呼吸速率作為一種客觀(guān)的代謝指標，可以與傳統的形態(tài)學(xué)評估相結合，進(jìn)一步提高胚胎分類(lèi)和選擇的準確性。這種結合評估方法有望為胚胎移植的成功率提供更可靠的預測依據，減少失敗妊娠和多胎妊娠的風(fēng)險。結果表明，unisense超微呼吸系統可用于準確、快速(8分鐘)測量不同發(fā)育階段單個(gè)胚胎的呼吸速率。呼吸速率與胚胎形態(tài)只有部分吻合，這表明這兩種方法在評估胚胎質(zhì)量方面略有差異。對胚胎呼吸和形態(tài)進(jìn)行綜合評估可能會(huì )改進(jìn)胚胎分類(lèi)和后續篩選工作。

圖1、完整的超微呼吸系統。溫控水浴通過(guò)兩根硅膠管(圖中未顯示)與玻璃培養室中的加熱螺旋進(jìn)一步連接。MMS；微機械手系統。

圖2、(A)帶有胚胎的單根花環(huán)毛細管示意圖，(B)從上往下看組成“花環(huán)”的七根熔融玻璃毛細管，(C)納米吸氣裝置?；ōh(huán)安裝在中央花環(huán)盤(pán)中，可以旋轉花環(huán)盤(pán)，使另一根毛細管與電極對齊。圓盤(pán)上的數字用于跟蹤正在研究的毛細管。電極位于毛細管上方。承載圓盤(pán)的聚砜圓筒和左側的桿是圓盤(pán)支架，測量時(shí)將其浸入裝有介質(zhì)的燒杯中。

圖3、由5個(gè)第7天胚泡的呼吸速率產(chǎn)生的氧梯度記錄。對照梯度相當于空毛細管中的測量值，作為負參考(=無(wú)呼吸活動(dòng))。每個(gè)梯度的斜率針對每個(gè)胚胎。

圖4、對同一胚胎進(jìn)行的第一次和第二次氧氣測量之間的關(guān)系，測量間隔為76±8分鐘。

圖5、呼吸速率與第7天體外生產(chǎn)的牛囊胚直徑之間的關(guān)系。

結論與展望

本研究通過(guò)引入一種新型的高分辨率微傳感器測試系統，成功實(shí)現了對牛體外生產(chǎn)胚胎呼吸速率的非侵入式、快速且準確的測量。研究結果表明，呼吸速率可以作為一種有效的胚胎質(zhì)量評估指標，尤其是在結合傳統形態(tài)學(xué)評估時(shí)，能夠進(jìn)一步提高胚胎分類(lèi)和選擇的準確性。unisense超微呼吸系統具有高精度、高重復性和非侵入性的特點(diǎn)。實(shí)驗結果表明，兩次測量的呼吸速率高度一致（R2=0.9705），且系統在空毛細管中的氧氣消耗極低（0.034±0.055 nl/h），表明系統具有極低的背景干擾和測量誤差。研究結果表明，胚胎的呼吸速率與其發(fā)育階段、形態(tài)學(xué)質(zhì)量以及直徑密切相關(guān)。通過(guò)使用新型微傳感器系統成功測量了牛體外生產(chǎn)胚胎的呼吸速率，并驗證了其在胚胎質(zhì)量評估中的潛在應用價(jià)值。這種技術(shù)為胚胎評估提供了一種新的、客觀(guān)的手段，有望推動(dòng)胚胎評估技術(shù)向更加科學(xué)、精準的方向發(fā)展。