結果和討論

同時(shí)進(jìn)行偶氮還原和電流生成。 在MFC或NA反應器中，莧菜紅在28小時(shí)內完全還原（圖1A），但含有10 mM莧菜紅的MFC除外，其中0.7 mM莧菜紅因電子供體耗盡而殘留。 在非生物反應器中未檢測到莧菜紅還原。 MFC中的莧菜紅還原率通常低于含有相同莧菜紅濃度的NA反應器中的還原率，這表明電流的產(chǎn)生使一些電子流偏離了偶氮還原。 此外，所有反應器中的莧菜紅還原率隨著(zhù)莧菜紅濃度的增加而增加，盡管我們研究中使用的偶氮染料濃度（高達10 mM）高于其他報告中使用的濃度，31表明該菌株具有較高的偶氮還原能力。

圖1。 同時(shí)減少莧菜紅和電流產(chǎn)生。 （A） 在MFC（實(shí)線(xiàn)）和NA反應器（虛線(xiàn)）中還原不同濃度的莧菜紅。 插圖顯示了MFC和NA反應器中莧菜紅的還原速率。 （B） 含有不同濃度莧菜紅的MFC中的當前世代。

圖1B顯示了當前一代帶有或不帶莧菜紅的MFC（完整的當前一代周期如圖S3所示，支持信息）。 莧菜MFC在接種時(shí)產(chǎn)生0.01 mA的電流，而帶有莧菜紅的MFC在電流產(chǎn)生之前有大約8 h的滯后期（圖1B），這表明浮游細胞更喜歡莧菜紅作為電子受體而不是陽(yáng)極。 伴隨著(zhù)偶氮還原，含有莧菜紅的MFC的電流在滯后階段后迅速增加，幾乎是不含莧菜紅的MFC的2倍（即，含有2、5、7和10 mM莧菜紅的MFC的電流分別為0.3、0.34、0.29和0.28 mA，而不含莧菜紅的MFC的電流為0.13 mA）。 在含有莧菜紅的MFC中產(chǎn)生的增強電流可歸因于莧菜紅還原產(chǎn)生的萘酚的電子介體作用。含有5 mM莧菜紅的9個(gè)MFC產(chǎn)生的電流最高， 由于毒性，在較高莧菜紅濃度下觀(guān)察到脫色S.細胞的代謝活性降低（圖S4，支持信息）。32因此，在后續實(shí)驗中，5 mM莧菜紅被用作替代電子受體。

浮游生物和生物膜細胞生長(cháng)。 含有莧菜紅的MFC中基于蛋白質(zhì)的浮游生物量約為無(wú)莧菜紅MFC的兩倍，但與具有相同莧菜紅濃度的NA反應器中的浮游生物量無(wú)顯著(zhù)差異（圖2A）。 結果表明，陽(yáng)極呼吸對浮游細胞的生長(cháng)沒(méi)有顯著(zhù)影響，即浮游細胞的生長(cháng)主要由莧菜紅還原而不是電極呼吸驅動(dòng)。 這與先前的報告一致，即脫色鏈球菌當前的產(chǎn)生是以生物膜為主，陽(yáng)極呼吸的脫色鏈球菌細胞更傾向于附著(zhù)在陽(yáng)極表面，而不是懸浮在培養液中。 33,34 含有莧菜紅的MFC中基于蛋白質(zhì)的浮游生物量約為無(wú)莧菜紅MFC的兩倍，但與具有相同莧菜紅濃度的NA反應器中的浮游生物量無(wú)顯著(zhù)差異（圖2A）。結果表明，陽(yáng)極呼吸對浮游細胞的生長(cháng)沒(méi)有顯著(zhù)影響，即浮游細胞的生長(cháng)主要由莧菜紅還原而不是電極呼吸驅動(dòng)。這與先前的報告一致，即脫色鏈球菌當前的產(chǎn)生是以生物膜為主，陽(yáng)極呼吸的脫色鏈球菌細胞更傾向于附著(zhù)在陽(yáng)極表面，而不是懸浮在培養液中。33,34

圖2。 脫色鏈球菌的生長(cháng)受不同電子受體的影響。 （A） 蛋白質(zhì)濃度的變化，作為有無(wú)莧菜紅（5 mM）或鈉反應器的MFC中浮游細胞的指標。 （B） 32小時(shí)后，帶有或不帶有莧菜紅或鈉反應器的MFC陽(yáng)極上的蛋白質(zhì)含量。

與浮游細胞不同，含有莧菜紅的MFC中陽(yáng)極生物膜的蛋白質(zhì)含量顯著(zhù)高于不含莧菜紅的MFC（P<0.01）和NA反應器（P<0.05）（圖2B），表明偶氮還原和電流生成都有助于生物膜的生長(cháng)。 生物膜生物量的差異表明，在含有莧菜紅的MFC中，偶氮還原占生物膜生物量的主要部分，而當前一代占較小的部分。 這些生物量差異與基于吉布斯自由能計算的預期差異一致，這表明莧菜紅還原產(chǎn)生的自由能可能高出3倍以上( 生物膜生物量的差異表明，在含有莧菜紅的MFC中，偶氮還原占生物膜生物量的主要部分，而當前一代占較小的部分。這些生物量差異與基于吉布斯自由能計算的預期差異一致，這表明莧菜紅還原產(chǎn)生的自由能可能高出3倍以上(?61.8 J，用公式S1計算，支持信息）比陽(yáng)極呼吸產(chǎn)生的值高(?17.7 J，用等式S2計算，支持信息），在含有5 mM莧菜紅的MFC中。

生物膜中的pH和氧化還原電位曲線(xiàn)。 用O2微電極進(jìn)行的測量證實(shí)，在實(shí)驗過(guò)程中，散裝液體是缺氧的（圖S5，支持信息）。 pH微電極測量（圖3A，B）表明，隨著(zhù)細胞生長(cháng)，體積液體pH值降低，即，含有莧菜紅的MFC（6.43）<NA反應器（6.55）<無(wú)莧菜紅的MFC（6.65），表明謝瓦納菌細胞外呼吸期間分泌酸性代謝物。 由于細菌電極呼吸是一種質(zhì)子釋放反應，因此含莧菜紅的MFC中電流產(chǎn)生的更大增加也會(huì )降低pH值。 在無(wú)莧菜紅的MFC的生物膜中觀(guān)察到pH梯度下降（約0.02），這表明質(zhì)子在陽(yáng)極呼吸生物膜中的積累與之前的預測一致。35本研究中觀(guān)察到的pH梯度小于在其他陽(yáng)極呼吸生物膜中觀(guān)察到的pH梯度（0.08到1個(gè)單位）， 17,36這可能是由于較薄的生物膜或Shewanella生物膜相對較高的擴散效率。37與陽(yáng)極呼吸生物膜相比，分別與陽(yáng)極和莧菜呼吸或僅與莧菜呼吸時(shí)，生物膜中的pH梯度降低或消失。 這是因為質(zhì)子可能被莧菜紅還原生成的萘胺所消耗。

用氧化還原微電極測定了不同生物膜內的氧化還原電位。 無(wú)細胞反應器的結果表明，莧菜紅對氧化還原電位曲線(xiàn)沒(méi)有任何顯著(zhù)影響（圖S6，支持信息）。 所有接種反應器的散裝液體中的氧化還原電位從陽(yáng)極表面上方約4mm處向陽(yáng)極急劇下降（圖3C），表明還原當量的累積在生物膜之外的可測量距離（幾毫米）處開(kāi)始。 無(wú)論使用何種電子受體，所有生物膜內的電位持續降低約30 mV（圖3C，D）。 Shewanella細胞和電極之間的電子轉移基本上是由黃素作為外膜細胞色素c（如MtrC/OmcA）的輔因子介導的，這已在菌株S12.12,24,38催化的MFC中得到證實(shí)。 生物膜中的pH變化可能導致1.2或2.4 mV的電位梯度 17莧菜紅呼吸生物膜電極表面電位下降是預期的，因為電子從生物膜轉移并逐漸氧化為散裝液體，如生物膜呼吸中所觀(guān)察到的 39,40 Picioreanu及其同事預測，含有電子介體的陽(yáng)極呼吸生物膜內的氧化還原電位會(huì )隨著(zhù)電子介體的氧化還原狀態(tài)先降低，然后升高。 35該預測適用于Shewanella生物膜，正如Shewanella陽(yáng)極呼吸一樣 38陽(yáng)極呼吸生物膜內的電位持續下降至 17 無(wú)細胞反應器的結果表明，莧菜紅對氧化還原電位曲線(xiàn)沒(méi)有任何顯著(zhù)影響（圖S6，支持信息）。所有接種反應器的散裝液體中的氧化還原電位從陽(yáng)極表面上方約4mm處向陽(yáng)極急劇下降（圖3C），表明還原當量的累積在生物膜之外的可測量距離（幾毫米）處開(kāi)始。無(wú)論使用何種電子受體，所有生物膜內的電位持續降低約30 mV（圖3C，D）。Shewanella細胞和電極之間的電子轉移基本上是由黃素作為外膜細胞色素c（如MtrC/OmcA）的輔因子介導的，這已在菌株S12.12,24,38催化的MFC中得到證實(shí)。生物膜中的pH變化可能導致1.2或2.4 mV的電位梯度（分別針對一個(gè)或兩個(gè)電子轉移過(guò)程，使用公式S3計算，支持信息），其遠小于檢測生物膜中的電位梯度（30 mV）這與Shewanella陽(yáng)極生物膜電位下降與pH無(wú)關(guān)的建議一致。17莧菜紅呼吸生物膜電極表面電位下降是預期的，因為電子從生物膜轉移并逐漸氧化為散裝液體，如生物膜呼吸中所觀(guān)察到的與氧、硫酸鹽或硝酸鹽混合。39,40 Picioreanu及其同事預測，含有電子介體的陽(yáng)極呼吸生物膜內的氧化還原電位會(huì )隨著(zhù)電子介體的氧化還原狀態(tài)先降低，然后升高。35該預測適用于Shewanella生物膜，正如Shewanella陽(yáng)極呼吸一樣受到電子介質(zhì)，即黃素的抑制。38陽(yáng)極呼吸生物膜內的電位持續下降至?然后在陽(yáng)極表面幾微米（<10μm）范圍內，340 mV顯著(zhù)增加至102 mV，這與上述預測一致，并且與使用極化陽(yáng)極呼吸的S.oneidensis MR-1生物膜中的電位分布相似。17

圖3.不同反應器中陽(yáng)極上方的pH和氧化還原電位分布。（A）從液體表面到陽(yáng)極表面的pH分布。（B）陽(yáng)極表面上方95μm范圍內pH分布的放大。（C）從液體表面到陽(yáng)極表面的氧化還原電位分布。（D） 陽(yáng)極表面上方95μm范圍內的電位分布放大。0μm深度代表生物膜 ? 陽(yáng)極界面，虛線(xiàn)表示近似的生物膜 ? 液體界面（紅色表示莧菜呼吸生物膜；綠色表示陽(yáng)極呼吸生物膜；藍色表示生物膜同時(shí)呼吸），通過(guò)實(shí)時(shí)顯微鏡監測（300×）和CLSM生物膜結構觀(guān)察確定界面。

陽(yáng)極表面電位( ?含有莧菜紅的MFC和不含莧菜紅的MFC（分別為68或102 mV）遠高于相應的生物膜電位。此外，可通過(guò)改變陰極條件來(lái)調節陽(yáng)極表面電位，即斷開(kāi)外部電路或降低陰極鐵氰化物濃度可顯著(zhù)降低MFC陽(yáng)極表面電位，當連接鈉反應器的陽(yáng)極和陰極時(shí)，可能會(huì )導致陽(yáng)極表面電位急劇增加，并立即產(chǎn)生電流（0.2 mA，圖S7，支持信息）。然而，這種陰極變化并未對所有反應器中的生物膜電位產(chǎn)生直接影響，表明生物膜內的氧化還原狀態(tài)不受影響。通過(guò)生物膜和陽(yáng)極表面之間的電位間隙進(jìn)行電子轉移產(chǎn)生的能量將由細菌細胞而不是電流產(chǎn)生來(lái)保存。28因此，適當降低陽(yáng)極表面電位可能會(huì )增加陰極?陽(yáng)極電壓和增加MFC電流的產(chǎn)生。Shewanella陽(yáng)極呼吸生物膜內的電位下降趨勢與地桿菌生物膜相反?；谏锬る娮虞d體（PilA、細胞色素c或黃素）和擴散效率的差異，在兩種模型外生電子的生物膜內可以假設13種不同的電子轉移機制。

圖4。 不同電子受體呼吸的生物膜內的活性分布。 A、 B和C分別是在CLSM下觀(guān)察到的莧菜紅呼吸生物膜、陽(yáng)極呼吸生物膜和同時(shí)莧菜紅和陽(yáng)極呼吸生物膜的垂直截面。 D、 E和F分別是基于莧菜紅呼吸生物膜、陽(yáng)極呼吸生物膜和同時(shí)莧菜紅和陽(yáng)極呼吸生物膜的CLSM結果的定量活性曲線(xiàn)。 低活性和受損膜的細胞呈紅色，而高活性和完整膜的細胞呈綠色。 0μm處的生物膜層為生物膜 ? 電極界面（底部）。

生物膜內的活性分層。 在所有生物膜中均觀(guān)察到不均勻分布的塔狀細胞簇結構。 與生物膜蛋白含量的觀(guān)察類(lèi)似，含有莧菜的MFC中的生物膜（48μm）比莧菜MFC（32μm）或NA反應器（41μm）中的生物膜厚（圖4）。 活性染色顯示，陽(yáng)極和莧菜紅共同呼吸的生物膜總活性（0.97）高于僅陽(yáng)極和莧菜紅呼吸的生物膜（0.94）或莧菜紅（0.66）。 僅用莧菜紅呼吸的生物膜的活性從電極上增加 ? 生物膜與生物膜的界面（底部，0.66） ? 液體界面（頂部，0.96）。 該曲線(xiàn)與呼吸氧氣或其他可溶性電子受體的生物膜中的曲線(xiàn)一致。22,41相反，陽(yáng)極呼吸生物膜中的活性分層從底部（0.99）下降到頂層（0.81），類(lèi)似于S.oneidensis MR-1、G.sulfurreducens、， 銅綠假單胞菌和革蘭氏陽(yáng)性細菌Thermincola potens。 23,42,43可以用生物膜中的電子跳躍電子轉移機制來(lái)解釋?zhuān)瑹o(wú)法接近陽(yáng)極表面的細菌細胞不能以足夠的速率將電子轉移到陽(yáng)極， 這將生物膜細胞的細胞代謝活性限制在閾值距離內。13,44這也可以解釋為什么Shewanella陽(yáng)極呼吸生物膜的厚度通常限制在幾十微米以?xún)取?4相反， Geobacter陽(yáng)極呼吸生物膜的厚度可以達到數百微米，并保持均勻的導電性，14盡管其擴散效率低于Shewanella生物膜，37進(jìn)一步表明Shewanella使用不同的電子轉移機制。 陽(yáng)極呼吸生物膜底部的高活性也排除了莧菜呼吸生物膜中活性降低是由于質(zhì)子積累或缺乏乳酸引起的可能性。 因此，僅使用陽(yáng)極或莧菜紅呼吸的生物膜內的反向活性曲線(xiàn)依賴(lài)于電子受體，并且與假定的電子轉移曲線(xiàn)一致。 這在同時(shí)呼吸陽(yáng)極和莧菜紅的生物膜中有所不同，這表明在生物膜中具有更高的均勻活性， 表明生物膜內的雙向電子轉移可以補償陽(yáng)極或莧菜紅作為唯一電子受體無(wú)法接近的生物膜細胞的活力損失。

生物膜的呼吸系統和生理層次中的電子受體的依賴(lài)性——摘要、介紹

生物膜的呼吸系統和生理層次中的電子受體的依賴(lài)性——材料和方法

生物膜的呼吸系統和生理層次中的電子受體的依賴(lài)性——結果和討論

生物膜的呼吸系統和生理層次中的電子受體的依賴(lài)性——結論、致謝！