大鯢(Andrias davidianus)屬兩棲綱有尾目隱鰓鯢科，為國家二級保護動(dòng)物，是兩棲綱動(dòng)物的最大物種，也是動(dòng)物進(jìn)化的“活化石”。大鯢屬肉食性動(dòng)物，食性主要為蛋白類(lèi)食物。大鯢的生長(cháng)發(fā)育及攝食種類(lèi)受季節性影響較大，大鯢是兩棲綱與爬行綱的過(guò)渡類(lèi)群，其消化道結構復雜，腸道微生物組成多樣。研究大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性不僅可以給野生大鯢保護提供依據，也可以為大鯢人工化養殖預防病害提供依據。

本論文研究以野生大鯢與養殖大鯢兩種樣品為實(shí)驗材料，通過(guò)微生物純培養技術(shù)與免培養技術(shù)全面的分析兩類(lèi)生境下的大鯢腸道微生物的組成與群落多樣性分析；通過(guò)微生物胞外酶研究方法對兩種樣品進(jìn)行腸道細菌產(chǎn)胞外酶篩選。野生大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性分析采用純培養技術(shù)分離野生大鯢腸道細菌，選用引物27F/1492R擴增后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

結果表明，野生大鯢分離到的86株腸道細菌可劃分為2個(gè)門(mén)6個(gè)屬，變形菌門(mén)(Proteobacteria，80.23%)：羅維登斯菌屬，愛(ài)德華氏菌屬，檸檬酸桿菌屬；厚壁菌門(mén)(Firmicutes，19.77%)：漫游球菌屬，芽孢桿菌屬，賴(lài)氨酸芽孢菌屬。應用胞外酶培養基篩選野生大鯢腸道微生物胞外酶活性。結果表明，野生大鯢分離到的86株腸道細菌，產(chǎn)蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)及脂肪酶(Lipase)菌株依次占總數的96.51%，73.26%，94.19%，5.82%。

采用免培養技術(shù)提取野生大鯢腸道內容物總DNA，選用引物799F/1492R進(jìn)行特性擴增后連接至載體并轉化，選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選，使用限制性核酸內切酶Hae III進(jìn)行(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測序，并鑒定到屬。結果表明，野生大鯢腸道細菌的101個(gè)克隆單元可劃分為3個(gè)門(mén)16個(gè)屬，變形菌門(mén)(Proteobacteria，94.06%)：氣單胞菌屬，不動(dòng)桿菌屬，慢生根瘤菌屬，鞘脂單胞菌屬，德沃斯氏菌屬，假單胞菌屬，勒克菌屬，拉烏爾菌屬，泛菌屬，黃色單胞菌屬，腸桿菌屬；厚壁菌門(mén)(Firmicutes，3.96%)：梭菌屬，枝芽孢桿菌屬，芽孢菌屬。衣原體門(mén)(Chlamydiae，1.98%)：嗜衣體屬。

采用免培養技術(shù)提取大鯢腸道總DNA，選用古菌特異性109F/958R和Met86F/Met1340R引物擴增后連接至載體pMD-19T并轉化，選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選，使用限制性核酸內切酶Afa I進(jìn)行(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測序，并鑒定。結果表明，野生大鯢腸道古菌的49個(gè)克隆單元可劃分為1個(gè)門(mén)2個(gè)綱，廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)：熱源體綱(Thermoplasmata，12.24%)，甲烷菌綱(Methanoplasmatales，4.08%)，未分類(lèi)到綱古菌(Uncultured Archaeon，73.48%)。養殖大鯢腸道微生物多樣性及產(chǎn)酶活性分析采用純培養技術(shù)分離養殖大鯢腸道細菌，選用引物799F/1492R擴增后進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定到屬。

結果表明，養殖大鯢分離到的97株腸道細菌可分為3個(gè)門(mén)16個(gè)屬，變形菌門(mén)(Proteobacteria，87.63%)：愛(ài)德華氏菌屬，志賀氏菌屬，沙雷氏菌屬，埃希氏菌屬，沙門(mén)氏菌屬，肥桿菌屬，鄰單胞菌屬，耶爾辛氏菌屬，腸桿菌屬，孤菌屬，克呂沃氏菌屬，克雷伯氏菌屬，氣單胞菌屬，假單胞菌；厚壁菌門(mén)(Firmicutes，7.22%)：芽孢桿菌屬；放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria，5.15%)：短桿菌屬。應用胞外酶篩選培養基篩選腸道微生物胞外酶活性。結果表明，養殖大鯢分離到的97株腸道細菌產(chǎn)蛋白酶(Proteinase)、淀粉酶(Amylase)、纖維素酶(Cellulase)菌株占總數的89.69%，73.20%，86.60%。采用免培養技術(shù)提取養殖大鯢腸道內容物總DNA，選用引物799F/1492R進(jìn)行特性擴增后連接至載體并轉化，選用質(zhì)粒引物M13+/M13-篩選并(PCR-RFLP)分析后進(jìn)行測序，鑒定到屬。

結果表明，養殖大鯢腸道細菌的105個(gè)克隆單元可劃分為4個(gè)門(mén)15個(gè)屬，變形菌門(mén)(Proteobacteria，71.42%)：埃希氏菌屬，志賀氏菌屬，沙雷氏菌屬，耶爾辛氏菌屬，食堿菌屬，沙門(mén)氏菌屬，哈夫尼菌屬，希萬(wàn)氏菌屬，布丘氏菌屬；厚壁菌門(mén)(Firmicutes，7.62%)：芽孢桿菌屬，葡萄球菌屬；放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria，20.01%)：短桿菌屬，戈登氏桿菌屬，紅蝽桿菌屬；擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，0.95%)：理研菌屬。