【摘要】：細胞電融合技術(shù)自從由Zimmermann發(fā)明以來(lái)，就因為效率高、可控性強、操作簡(jiǎn)便、重復性好、對細胞無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應用，逐漸成為現代生物工程技術(shù)中的一個(gè)重要工具，被廣泛應用于物種產(chǎn)生或改良、單克隆抗體制備、癌癥免疫治療等領(lǐng)域。本文運用現代微機電系統(micro electro mechanical systems，MEMS)加工技術(shù)在厘米見(jiàn)方的基底材料上制作了微電極陣列細胞電融合芯片。所包含的微電極對數達到103數量級，微電極間距小于100μm。同時(shí)，研究開(kāi)發(fā)了細胞電融合儀，可以與芯片集成為高通量細胞電融合系統，并利用介電電泳和細胞電致穿孔原理實(shí)現細胞操控和電融合。細胞定位、穿孔及擠壓操作是細胞電融合的基礎。因此，本文首先對細胞操控和電融合原理進(jìn)行了深入的探討，在此基礎上運用有限元方法分析了不同形狀、分布的微電極陣列在外加電壓條件下的電場(chǎng)分布，并以此為據來(lái)優(yōu)化微電極和微電極陣列設計，以獲得有利于細胞電融合的電場(chǎng)環(huán)境。在此期間確定了矩形梳狀交叉微電極陣列芯片模型。

隨后，對芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進(jìn)行了研究，成功研制了硅基底-硅微電極、玻璃基底-硅微電極、硅基底-全金屬微電極、電路板(printed circuit board，PCB)微電極等四種不同材料的細胞電融合芯片。同時(shí)，研制開(kāi)發(fā)了細胞電融合儀。最后，在芯片和融合儀組成的高通量細胞電融合平臺上進(jìn)行了微生物、動(dòng)物、植物細胞電融合實(shí)驗。

具體來(lái)說(shuō)，論文研究工作主要包括以下幾個(gè)方面:

1.芯片上微電極尺寸及分布對電場(chǎng)強度及梯度的影響。在細胞融合芯片上，三維微電極的幾何及分布參數包括微電極厚度、寬度、深度、縱向間隔、橫向間隔，微電極尖端幾何形狀(直角形齒、錐形齒、平行板)，電極排列方式(對稱(chēng)性和非對稱(chēng)型)等。這些參數的改變都會(huì )對微通道中的電場(chǎng)強度及梯度產(chǎn)生影響。通過(guò)有限元方法，對微電極陣列進(jìn)行了建模仿真。根據細胞電融合的要求，提出了一種有利于細胞電融合的矩形梳狀交叉微電極陣列芯片模型，為實(shí)現高效細胞電融合奠定了理論基礎。在該芯片中，可以產(chǎn)生有利于細胞電融合的電場(chǎng)環(huán)境，提高對細胞的操控能力和融合率。

2.芯片和微電極材料及制作工藝的選擇。為了使細胞電融合芯片獲得最佳的電氣和生化性能，本文研究了全硅微電極、硅玻結合(玻璃基底加硅微電極)、硅基底全金屬微電極、PCB銅電極等四種芯片，包括其微電極和微通道設計、加工工藝選擇、封裝設計和材料選擇等。

3.細胞電融合儀的設計及制作。在研究了細胞電融合過(guò)程中涉及到的細胞操作，即排隊、電穿孔、擠壓等三個(gè)基本過(guò)程及所需電信號特征后，提出了用單頻正弦信號和雙向歸零高壓脈沖信號作為細胞電融合的最佳操控與穿孔信號。在此基礎上，設計了信號產(chǎn)生電路、智能控制電路、顯示電路、高壓電源電路并進(jìn)行相應的軟件編寫(xiě)、PCB設計、電子裝配與調試，參數測試等，獲得了可以提供高通量細胞電融合所需電信號的細胞電融合儀，其技術(shù)指標達到國內先進(jìn)水平。

4.細胞電融合實(shí)驗研究。利用新研制的芯片和融合儀建立了細胞電融合實(shí)驗平臺，開(kāi)展了微生物(酵母細胞)、動(dòng)物(HEK-293、雞血細胞)、植物(煙草葉肉原生質(zhì)體)細胞的排隊或融合實(shí)驗。結果表明，芯片內數量巨大微電極(103對/cm2數量級)可以同時(shí)操控大量細胞來(lái)完成排隊和電穿孔，從而實(shí)現高通量電融合。另一方面，由于微電極間距小到微米數量級，細胞操作和融合所需電壓很低，如細胞排隊電壓(Vpp)在6 V左右即可達到滿(mǎn)意效果，電穿孔脈沖電壓幅值也小于60 V。這樣，融合電壓的降低提高了細胞電融合系統安全性，也降低了電融合儀的設計要求和生產(chǎn)成本。通過(guò)一系列分析、仿真及實(shí)驗研究，使芯片內微電極的設計、選材及加工工藝得以?xún)?yōu)化，可以產(chǎn)生更有利于細胞電融合的電場(chǎng)和電場(chǎng)梯度分布。實(shí)驗結果表明，芯片上的細胞電融合可以獲得較高的電融合率。以煙草葉肉原生質(zhì)體的電融合為例，其融合率最高達到50.2%。動(dòng)物細胞HEK-293的融合率最高也達39.1%，酵母細胞最高達33.4%，這些都較傳統的利用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)的化學(xué)融合方法的融合率(1%)和傳統電融合儀器上的融合率(10%)高出很多?？傊?，通過(guò)對細胞電融合芯片電極設計以及電學(xué)特性的研究，研制出高通量、高融合率的細胞電融合芯片，并根據細胞電融合過(guò)程和所需電信號要求，研制開(kāi)發(fā)出智能化細胞電融合儀。集成融合芯片及電融合儀建立了細胞電融合微系統實(shí)驗平臺，在對微生物、動(dòng)物、植物原生質(zhì)體等細胞的電融合實(shí)驗中，取得了很好的實(shí)驗效果。該研究為實(shí)現細胞電融合系統微型化、建立高效、自動(dòng)的細胞融合芯片實(shí)驗室奠定了良好的基礎。