為了便于鏡下觀(guān)察，基于細胞培養的嗅球神經(jīng)元是主要的實(shí)驗對象之一。目前對離體嗅球神經(jīng)元的電信號檢測主要是膜片鉗記錄技術(shù)。隨著(zhù)微電子機械加工技術(shù)(MEMS)的發(fā)展，微電極陣列(microelectrode array，MEA)、光尋址電位傳感器(light addressable potentiometric sensor，LAPS)和場(chǎng)效應晶體管(field effect transistor，FET)等微傳感技術(shù)在生物信號檢測中得到迅速發(fā)展和廣泛應用。曾經(jīng)將嗅球神經(jīng)元培養在LAPS芯片上觀(guān)察氣味對僧帽細胞有無(wú)響應，作為研究嗅覺(jué)受體神經(jīng)元對氣味響應的實(shí)驗對照。下面是操作步驟：

1.1器件準備

微電極陣列MEA的制作采用標準微電子制作工藝：5吋玻璃基底(厚度500μm)經(jīng)過(guò)標準清洗后在表面磁控濺射一層厚度100～500?的Cr或Ti-W薄膜作為中間層，然后再濺射厚度為2000～5000?的Au薄膜形成電極層;濺射完成后，沉積一層聚酰亞胺或光刻膠作為絕緣層，并通過(guò)反應離子刻蝕技術(shù)(reactive ionetching，RIE)刻蝕暴露出金電極陣列圖形。將器件固定在PCB座上，利用點(diǎn)焊技術(shù)將器件上的焊點(diǎn)與PCB板上的焊盤(pán)用金線(xiàn)連通。然后用生物相容性較好的環(huán)氧樹(shù)脂覆蓋焊絲，粘接測試腔，室溫固化，得到如圖1(a)所示的器件。

圖1器件。(a)封裝的器件;(b)電鍍鉑黑的MEA顯微照片

為了降低熱噪聲，提高細胞胞外信號檢測的信噪比，本實(shí)驗對MEA金電極表面電鍍鉑黑顆粒，以增加電極的表面積，降低電極阻抗。電鍍系統采用三電極系統與CHI660 C型電化學(xué)工作站，每個(gè)電極的電鍍時(shí)間約45 s。最后得到的MEA顯微如圖1(b)所示，電極直徑為30μm。

1.2細胞培養

嗅球細胞的培養與大多數神經(jīng)元培養方法相似。將新生SD乳鼠(1～3 d)剪取鼠頭，將其放入酒精中消毒1～2 min后，立即轉入盛有磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)的無(wú)菌培養皿中。剪開(kāi)頭皮，撥開(kāi)顱骨，暴露全腦。輕輕剝離兩側嗅球，放于另一無(wú)菌盛有PBS的培養皿中。輕輕剝去被膜，然后將嗅球剪成1 mm3左右的組織塊，加入2 mL含10μg/L神經(jīng)生長(cháng)因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium)培養液中進(jìn)行吹打，制成細胞懸液，接種在MEA表面。24 h后全量換液，48 h后滴加5-氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)以抑制膠質(zhì)細胞的過(guò)度生長(cháng)。每3 d換液一次。培養5～7 d后，可以將芯片取出進(jìn)行觀(guān)察和測試。

1.3染色處理

為了更加清楚地觀(guān)察嗅球神經(jīng)元的形態(tài)和生長(cháng)狀態(tài)，信號測試結束后對細胞進(jìn)行染色處理。本實(shí)驗采用瑞士染色法，染液包括Ⅰ和Ⅱ兩組份，由堿性染料美藍和酸性染料伊紅分別配制而成。首先將細胞培養腔內的神經(jīng)測試液吸干;然后滴加適量染液Ⅰ于培養腔內，保證溶液浸沒(méi)細胞;1 min后將等量的染液Ⅱ滴加入培養腔，保證染液Ⅰ、Ⅱ均勻混合;大約5 min后用清水沖洗數遍;將培養腔內溶液吸干，置于顯微鏡下觀(guān)察。

1.4信號采集與分析

利用多通道放大器(MEDl6，Multichannel systems，GmbH，德國)，本實(shí)驗可以實(shí)現16通道的同步記錄，采樣頻率為10 kHz。

為了評估嗅球細胞網(wǎng)絡(luò )傳感器的檢測能力，選用嗅球內興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid，Glu)進(jìn)行了實(shí)驗研究[19]，觀(guān)察了Glu作用前后不同通道嗅球神經(jīng)元的響應。Glu溶液由正常神經(jīng)測試液配制而成，最終濃度為200μM。

信號的統計分析圖和光柵圖均通過(guò)Matlab軟件完成。