慢性肝?。–LD)常由肝脂肪變性、炎癥和纖維化引起,并成為肝硬化和肝癌的主要誘因。分子氫(H 2)是一種新興的廣譜抗炎分子,能夠在Fe-卟啉的催化氫化作用下中和包括·OH在內的細胞毒性氧自由基,在炎癥反應中表現出明顯的治療和無(wú)毒作用。能夠改善肝臟炎癥和代謝功能障礙,與傳統抗CLD藥物相比在生物安全性方面具有明顯優(yōu)勢,但現有的H2給藥途徑無(wú)法實(shí)現肝-H 2的靶向高劑量遞送,嚴重限制了其抗CLD功效。多項臨床試驗一致表明,通過(guò)飲用富氫水(HRW)可以改善CLD中的炎癥和代謝功能障礙。但每天的飲水量有限,H2的飽和溶解度相當低(在1個(gè)大氣壓下為1.6 mg/L),導致H2劑量相對較低,因此治療效果有限。氫氣吸入是另一種流行的抗CLD氫氣給藥途徑,但其高分散性和低溶解度導致肝臟中的低效積累,嚴重限制了氫氣吸入療法的抗CLD療效。H2的肝臟靶向高劑量遞送仍然是CLD的H2治療的挑戰。納米材料已被證明可在傷口愈合和癌癥化學(xué)療法中提供增強的治療效果。


近年來(lái)納米藥物在氧化應激誘導的疾病中表現出優(yōu)異的生物安全性、增強的特異性,提供了有前途的治療策略。本研究工作中,研究人員提出了用于CLD治療的局部氫捕獲和催化羥基自由基(·OH)氫化的概念。輕、中度非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型小鼠先靜脈注射PdH納米顆粒,整個(gè)治療期間每日吸入4%氫氣3 h。治療結束后,每天肌注谷胱甘肽(GSH)以輔助Pd排泄。


Unisense微電極系統的應用


使用氫微電極(Unisense)原位測量中度NASH小鼠肝臟中的H2濃度來(lái)確定體內氫捕獲情況。NASH小鼠靜脈注射10 mg/kg Pd顆粒,12 h后,吸入4%氫氣3 h。吸入氫氣后,通過(guò)腹膜內注射7 mL/kg 20%氨基甲酸乙酯立即麻醉小鼠。腹部正中切口暴露肝臟,Clark型氫氣微電極插入肝臟1mm,檢測局部H 2。實(shí)時(shí)集中麻醉和微電極穩定的整個(gè)過(guò)程僅用了3分鐘,并且在個(gè)體之間是一致的。僅使用不注入Pd的氫氣吸入作為對照,以區分肝臟中Pd納米粒子的局部氫捕獲能力。


實(shí)驗結果


體外和體內概念驗證實(shí)驗證實(shí),Pd納米顆粒在靜脈注射后可在肝臟中靶向蓄積,并發(fā)揮氫捕獲器和·OH過(guò)濾器的雙重作用,局部捕獲/儲存肝臟-在每日氫氣吸入過(guò)程中通過(guò)H2并快速催化·OH氫化成H2O。該療法通過(guò)展示廣泛的生物活性,包括調節脂質(zhì)代謝,顯著(zhù)改善氫療法在預防和治療NASH方面的效果和抗炎。Pd在治療結束后在GSH的協(xié)助下可大部分消除。

圖1、Pd納米粒子在肝臟中進(jìn)行局部氫捕獲和催化?OH氫化的治療策略和機制示意圖。

圖2、Pd納米粒子的尺寸表征、氫捕獲和催化氫化特性。PdH(A)和Pd納米粒子(B)的HR-TEM圖像(插入圖像是相應的選定區域電子衍射圖)、它們的水合直徑分布(C)、模擬的局部氫捕獲圖(D)和相應的紫外吸收演變(E)用于監測動(dòng)態(tài)過(guò)程(F),模擬催化加氫圖示(G)和相應的UV吸收演化(H)用于監測動(dòng)態(tài)過(guò)程(I)。

圖3、Pd納米顆粒在NASH模型中的肝臟靶向積累、局部氫捕獲和催化氫化行為。靜脈注射后Pd納米顆粒的生物分布和肝內滯留(A),通過(guò)氫電極實(shí)時(shí)原位監測NASH小鼠注射Pd和3小時(shí)氫氣吸入后肝臟中的氫濃度(n=6)(B),Pd納米顆粒催化氫化清除NASH小鼠肝臟中·OH的能力(C)。

圖4、PdH注射加氫氣吸入預防輕度NASH的治療效果。輕度NASH預防(A)、肝臟總膽固醇(B)和甘油三酯(C)含量、涉及IL-1β(D)、IL-6(E)和TNF-α(F)的全身炎癥水平的治療程序,以及治療結束時(shí)肝切片的H&E和油紅O染色(黑色箭頭指向代表中性甘油三酯和脂質(zhì)的紅點(diǎn))圖像(G)。

圖5、PdH注射加氫氣吸入緩解中度NASH的治療效果。模型構建和治療程序(A),血清細胞因子水平包括IL-1β(B),IL-6(C),TNF-α(D),IHC和α-SMA,CD68和F4/80的免疫熒光檢測肝切片(E)的水平,以及治療結束時(shí)肝切片的H&E、油紅O(指向代表中性甘油三酯和脂質(zhì)的紅點(diǎn)的黑色箭頭)和馬松三色染色(藍色代表膠原蛋白)圖像(F)。


結論與展望


本研究提出了局部氫捕獲和催化氫化抗CLD的新治療理念,并通過(guò)PdH納米粒子注射與氫氣吸入相結合的體外和體內成功驗證了這一理念。在輕度和中度NASH模型中,研究證實(shí)我們的治療策略通過(guò)改善肝臟脂質(zhì)代謝和局部/全身炎癥顯著(zhù)增強氫氣吸入的結果??紤]到分子氫和Pd納米粒子的生物安全性、單劑量注射PdH與吸入氫氣相結合的成本效益以及肝臟靶向作用,所提出的治療概念是臨床預防和治療CLD的有前途的策略。