背景介紹:隨著(zhù)水體的富營(yíng)養化，帶有微藻附生生物膜的海草葉過(guò)度生長(cháng)會(huì )增加，由于包括農業(yè)在內的土地徑流加速，這在沿海水域中是一個(gè)日益嚴重的問(wèn)題。富營(yíng)養化的增加會(huì )導致海草葉片的附生植物過(guò)度生長(cháng)，這對沿海水域的海草健康構成了重大威脅。然而對于附生植物如何影響海草葉球的關(guān)鍵生物地球化學(xué)條件和過(guò)程知之甚少。本論文的研究人員使用電化學(xué)微傳感器來(lái)測量裸露和附生植物覆蓋的海草葉表面的O2，pH和CO2的微梯度濃度，以確定附生植物對葉片化學(xué)微環(huán)境的影響。研究人員使用unisense的微電極剖面分析系統測量來(lái)確定附生生物膜對大葉藻葉片微環(huán)境中關(guān)鍵物理化學(xué)條件和過(guò)程的影響。研究表明在沒(méi)有和有附生微藻生物膜的情況下，首次實(shí)現了直接測量在沒(méi)有和有附生微藻生物膜的海草葉片表面二氧化碳濃度和動(dòng)態(tài)的直接測量，并與pH和O2的微剖面濃度測量相結合。這對附生植物對海草葉球微環(huán)境的影響的詳細測定是非常新穎的，并且使人們能夠洞察富營(yíng)養化引起的附生植物過(guò)度生長(cháng)下海草光合作用的關(guān)鍵調控機制。

Unisense微電極分析系統的應用

使用unisense的Clark型O2微型傳感器（OX-10，尖端直徑10μm，響應時(shí)間（1-3 s），用于測量從水到葉片組織表面的O2濃度曲線(xiàn)。pH微電極（pH-50，尖端直徑50μm）測量從水到葉片表面的pH分布。在三個(gè)pH緩沖液（pH 4、7和10）中根據信號讀數對pH微電極進(jìn)行線(xiàn)性校準，pH微電極與浸沒(méi)在流動(dòng)室中的參比電極（REF-RM；Unisense A/S，丹麥）結合使用。新型的Clark型CO2微電極傳感器（尖端直徑為20–100μm，檢出限<0.5μM，響應時(shí)間為160s）用于測量葉片表面的CO2濃度。CO2微電極傳感器在預先吹掃過(guò)的氮氣（N2）超純水，酸性（pH<4）超純水和已知CO2濃度（即0、37、74和111μM）的超純水水中進(jìn)行線(xiàn)性校準（四點(diǎn)）。

所有微電極傳感器都連接到unisense主機上，并安裝在電動(dòng)微操縱器（MM332）上。在進(jìn)行微剖面濃度分析之前，通過(guò)手動(dòng)操作微操縱器將微傳感器定位在葉片表面，同時(shí)用立體顯微鏡觀(guān)察微傳感器的尖端和葉片組織表面。當微傳感器尖端接觸到植物組織表面時(shí)，葉片略有移動(dòng)。其中O2微電極的移動(dòng)步徑為50μm，pH、O2微電極的移動(dòng)步徑為50μm，CO2的移動(dòng)步徑為為100μm。由于CO2微型傳感器的響應時(shí)間相對較長(cháng)，因此在厚附生層中選擇了200μm步徑。剖面測量從葉片表面上方2–3 mm的混合水柱開(kāi)始（取決于DBL的厚度和附生生物膜的厚度）朝向葉片組織的表面。為了在微剖面分析時(shí)確保穩態(tài)條件，當改變光照條件時(shí)，將微電極傳感器放置在葉片表面，并隨時(shí)間跟蹤微傳感器信號，直到達到新的穩定信號為止（大約45分鐘）。

實(shí)驗結果

附生植物生物膜會(huì )導致pH，O2的極端波動(dòng)，而海草葉片表面無(wú)機碳濃度嚴重影響了植物的生長(cháng)性能。在光照條件下，葉片附生生物膜及其擴散邊界層會(huì )導致強堿化作用，顯著(zhù)降低葉片表面的CO2和HCO3可用性，導致碳限制和光呼吸作用增強導致光合效率降低。對于附生植物，葉片表面的pH值增加到>10，從而超過(guò)最終pH值平均水平（?9.62）和活性光合作用的CO2補償點(diǎn)。在黑暗中，附生生物膜導致CO2增加葉片表面缺氧。附生植物會(huì )導致海草中嚴重的碳限制，這是由于葉球堿化作用強烈，導致二氧化碳消耗和昂貴但限制了HCO3-的利用，增加了植物饑餓的風(fēng)險。

圖1、微電極系統測試大葉藻葉片的表面的實(shí)驗裝置圖。（a）實(shí)驗裝置的圖像顯示無(wú)附生植物生物膜和有附生生物植物膜的海草（Z.marina L.）葉片效果圖，以及Clark型O 2微電極傳感器的尖端。（b）概念圖表示的是穿過(guò)擴散邊界層(DBL)和附生海草生物膜的O 2，CO2，HCO3-，pH剖面，以及假設附生植物在光照下對葉片微環(huán)境堿化的影響，從而對海草光合作用的無(wú)機碳（CI）有效性的影響。在這里，從海水到海草葉表面的總擴散距離（TDD）等于附生生物膜和真實(shí)DBL的總厚度（即生物膜/海水界面處稀薄的未攪拌水層）。

圖2、在沒(méi)有附生生物膜和有附生生物膜的葉狀球的海草的化學(xué)參數（O2、CO2、pH）微梯度。在入射光子輻照度(400-700 nm)為0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情況下，測量/計算了葉片表面的O2、CO2和pH的垂直濃度剖面(以及推導出的HCO3‐的濃度剖面)。黑色符號和線(xiàn)條表示沒(méi)有附生植物覆蓋的葉子（裸露的對照葉子；?附生植物）。紅色符號和線(xiàn)條表示帶有附生植物覆蓋物（+附生植物）的葉子。零距離（y=0）表示葉片組織表面?？倲U散距離的厚度確定為真實(shí)擴散邊界層中線(xiàn)性O 2濃度梯度與外推的散裝水O 2濃度相交的位置（圖1；在黑暗中和在300 mol光子?m-2?s–1下的O 2測量值之間的平均值?m?2?s-1，表示附生生物膜的大致厚度（黑色虛線(xiàn)；總擴散距離）。

圖3、葉片附生生物膜對大葉藻葉片表面化學(xué)微環(huán)境的影響（a和b）選定的微剖面顯示了O2（黑色），CO2（藍色），pH（紅色）的垂直濃度的動(dòng)態(tài)變化），以及所估計的HCO3-（綠色）。在入射光子輻照度(400-700 nm)為0、30和300 mol光子?m-2?s-1的情況下，測量計算了葉片表面的O2、CO2和pH的垂直濃度剖面(以及推導出的HCO3‐的估計濃度剖面)?？倲U散距離的厚度確定為真實(shí)擴散邊界層中線(xiàn)性O 2濃度梯度與外推的散裝水O 2濃度相交的位置。

圖4、附生植物誘導海草宿主的大葉藻微環(huán)境動(dòng)力學(xué)。在無(wú)附生生物膜和有附生生物膜的大葉藻葉片組織表面測量的pH值和O2、CO2和HCO3濃度的動(dòng)態(tài)范圍，在光子照射(400-700 nm)強度從0-300 mol光子?m-2?s–1，黑條表示沒(méi)有附生植物覆蓋的葉子（裸露的對照葉子；?附生植物）。紅色條代表帶有附生植物覆蓋物（+附生植物）的葉子。

圖5、附生生物膜厚度對pH值和無(wú)機碳有效性的影響。大葉藻葉片表面的CO2濃度和估算的HCO3‐?？倲U散距離的厚度被確定為真正擴散邊界層中線(xiàn)性的O2濃度梯度與外推的體積水O2濃度之間的距離。在0(黑色符號)、30 umol光子?m-2?s–1(藍色符號)和300 umol光子?m-2?s–1(紅色符號)的摩爾光子輻射下，測量了海草葉片表面pH值和CO2和HCO3‐濃度對擴散距離的響應。

結論與展望

研究人員通過(guò)使用unisense的微電極剖面分析系統測量來(lái)確定附生生物膜對大葉藻葉片微環(huán)境中關(guān)鍵物理化學(xué)條件和過(guò)程的影響。使用unisense微電極傳感器來(lái)測量裸露和附生植物覆蓋的海草葉表面的O2，pH和CO2的微梯度，以確定附生植物對葉片化學(xué)微環(huán)境的影響。研究了在沒(méi)有和有附生微藻生物膜的情況下，首次實(shí)現了直接測量在沒(méi)有和有附生微藻生物膜的海草葉片表面CO2濃度和動(dòng)態(tài)的直接測量，并與pH和O2的微剖面濃度測量相結合。這種對附生植物對大葉藻葉球微環(huán)境的影響的詳細測定，該研究使研究人員能夠洞察富營(yíng)養化引起的附生植物過(guò)度生長(cháng)下海草光合作用的關(guān)鍵調控機制。