細胞內Ca2+，H+與活性氧(reactive oxygen species,ROS)是植物體內廣泛存在的響應生物或非生物脅迫、調節植物生長(cháng)發(fā)育的因子。人們越來(lái)越傾向認為，這些調節因子所顯示的時(shí)空動(dòng)態(tài)復雜變化模式是它們信號行為的一部分。因此，檢測Ca2+，H+與ROS的動(dòng)態(tài)變化，是研究和了解這些細胞因子對植物起調節作用的關(guān)鍵。然而，上述無(wú)機信號分子在細胞內濃度等時(shí)空變化的有效檢測或監測手段一直較少。目前這些信號的顯像技術(shù)已經(jīng)出現，并且可以在細胞和亞細胞水平上對上述信號(分子)進(jìn)行原位實(shí)時(shí)定量鑒定。這些顯像或成像方法是基于一些小分子染料可以與Ca2+，H+和ROS發(fā)生專(zhuān)一性的相互作用、從而使染料熒光特性發(fā)生改變的原理。研究進(jìn)一步發(fā)現，使用綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)，可以在亞細胞尺度上，對Ca2+，H+和ROS信號分子進(jìn)行高分辨定位分析。

1 Ca2+在植物活細胞體內的成像

1.1細胞內Ca2+成像分子探針

Ca2+被認為是廣泛存在的細胞功能調節子，因此人們十分關(guān)注這種陽(yáng)離子在細胞內的時(shí)空變化水平，以期揭示出它是如何觸發(fā)細胞生理響應的。細胞質(zhì)Ca2+水平常常呈現出諸如“尖峰形成”和細胞內“鈣波”形式的變化、被認為是細胞間觸發(fā)信息傳遞的方式。解碼Ca2+“指紋”的生物化學(xué)耦聯(lián)，使得Ca2+信號能夠參與細胞對多種環(huán)境刺激響應的調節。Ca2+濃度過(guò)高時(shí)、它也是一種細胞毒素，在胞質(zhì)中其濃度為100 nM水平、而在細胞器內或質(zhì)外體Ca2+濃度大致在在1 mM水平。在細胞質(zhì)中，一旦Ca2+濃度超出100μM水平時(shí)間過(guò)長(cháng)，細胞功能將會(huì )因Ca2+沉積而遭到破壞。然而，Ca2+濃度在100μM水平上的增加，如果在時(shí)空上受到限制，細胞是可以耐受的。最典型的是植物根尖生長(cháng)點(diǎn)和伸長(cháng)區細胞。因此，對Ca2+濃度動(dòng)態(tài)變化模式的監測是研究Ca2+信號的關(guān)鍵。然而，Ca2+濃度瞬時(shí)變化的定位與成像卻面臨諸多挑戰。因為監測細胞質(zhì)Ca2+濃度的系統必須足夠靈敏、而且能夠檢測到100μM濃度范圍Ca2+的變化、并且要避免其他二價(jià)離子如Mg2+的干擾。

廣泛用來(lái)進(jìn)行植物細胞Ca2+顯像的染料，都含有一族碳酸殘基。這些染料通過(guò)碳酸殘基與Ca2+相互作用，使得其自身的熒光強度發(fā)生改變。例如，Ca2+熒光染料Green-1，Ca2+濃度從0到μM水平上的變化，可以使其熒光染料發(fā)光強度增加上百倍(圖1)?？梢越柚す夤簿劢够驘晒怙@微鏡，用肉眼觀(guān)察Ca2+染料熒光強度的增加，進(jìn)而推斷Ca2+濃度水平的變化。一旦知道Ca2+探針的解離系數，可以用簡(jiǎn)單的公式來(lái)確定Ca2+濃度變化：

Ca2+濃度=Kd[(F-Fmin)/(Fmax-F)]

上式中Kd為Ca2+對Ca2+染料的解離系數；F是測定的熒光強度；Fmax是飽和熒光強度；Fmin是無(wú)Ca2+時(shí)的熒光強度。

在使用以上描述過(guò)的方法過(guò)程中，人們發(fā)現熒光共振能量轉移(Fluorescent resonance energy transfer，FRET)，這一基于Ca2+綠色熒光受體蛋白(green fluorescent proteins，GFPs)的轉基因新技術(shù)，對于信號檢測來(lái)說(shuō)是很有吸引力的一項新技術(shù)。Palmer等分析研究了熒光共振能量轉移等成熟的技術(shù)方法，在實(shí)踐中有很強的應用價(jià)值。

1.2向植物細胞內加載Ca2+染料的方法

能與Ca2+相互作用的染料，均含有強烈的帶電基團、使得它們不易進(jìn)入細胞。因此，要使Ca2+染料順利進(jìn)入植物細胞，確實(shí)是個(gè)不小的挑戰。使細胞膜可逆性溶解或撕裂的技術(shù)，如電穿孔、去污劑增溶、微注射、膜片鉗、顆粒型傳送、或其它酸酯掩蓋電荷的方法，均可使染料順利進(jìn)入植物細胞。值得一提的是，染料在胞質(zhì)和細胞器內加載積累后、保持其完整性十分重要。因此，目前與葡聚糖相結合的染料分子、經(jīng)顯微注射加載進(jìn)入細胞的方法受到廣泛重視。

圖1 Ca2+敏感的熒光染料和綠色熒光蛋白的特性

(a)Ca2+傳感染料Calcium Green-1，Fura-2和Indo-1熒光發(fā)射與激發(fā)波普。這些染料的化學(xué)結構如下：(i)Ca2+結合后熒光強度增加的波長(cháng)，(ii)Ca2+結合后熒光強度不同步增加的輻射波長(cháng)，(iii)Ca2+結合后熒光強度下降的波長(cháng)。(b)彩色表示波普的范圍。(c)Ca2+響應的Ca2+傳感蛋白：鈣調素(calmodulin)結構域在2個(gè)Ca2+結合的能量轉移伴侶蛋白CFP和YFP之間；鈣調素結合Ca2+后，蛋白構象的改變使得CFP與YFP接近、FRET出現后導致激發(fā)態(tài)光產(chǎn)生。(d)Ca2傳感蛋白的熒光發(fā)射波普。Ca2+水平增加,CFP(FRET供體)輻射減弱,而YFP(FRET受體)輻射增加?？s略語(yǔ)：青色熒光蛋白CFP,cyan fluorescent protein；熒光共振能量轉移FRET,fluorescence resonance energy transfer；黃色熒光蛋白YFP,yellow fluorescent protein。