細胞電融合技術(shù)自發(fā)明以來(lái)，由于其可控性強、操作簡(jiǎn)便、對細胞無(wú)毒害等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應用，逐漸成為現代生物工程技術(shù)中的一個(gè)重要工具，被廣泛應用于雜交育種、單克隆抗體制備、藥物篩選等領(lǐng)域。隨著(zhù)微流控技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展，細胞電融合芯片技術(shù)在最近十幾年發(fā)展尤為迅速。細胞電融合芯片技術(shù)除了具有傳統細胞電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，還更精確高效、集成度高、便于實(shí)驗觀(guān)察、樣本消耗少，因此在國內外廣受關(guān)注。

本論文運用現代微加工技術(shù)制作了基于微電極陣列的細胞電融合芯片，利用介電電泳效應和細胞電穿孔原理實(shí)現細胞排隊和電融合。細胞排隊和電穿孔是電融合中兩個(gè)最重要的過(guò)程，本論文首先對它們的機制和模型進(jìn)行了深入探討。在此基礎上，運用有限元方法分析了介電電泳效應下細胞的運動(dòng)狀態(tài)以及電極結構對細胞跨膜電位分布的影響，并根據仿真結果來(lái)優(yōu)化微電極陣列芯片結構，使電融合過(guò)程控制得到優(yōu)化?；诜抡娣治鲈O計了離散式電極和離散式凹槽電極結構模型，并且對芯片加工工藝、材料、封裝技術(shù)等進(jìn)行了研究，成功研制了基于薄膜電極、離散式共面電極、離散式凹槽電極結構的細胞電融合芯片。最后，在芯片和融合儀組成的細胞電融合平臺上進(jìn)行了多種細胞的電融合實(shí)驗，驗證了新方法的有效性。

具體的說(shuō)，論文研究的主要工作包括以下幾點(diǎn):

①細胞電融合理論分析及仿真研究在細胞介電電泳、細胞電穿孔等相關(guān)理論研究基礎上，利用有限元分析軟件COMSOL Multiphysics#174；對芯片內介電電泳效應下的細胞運動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行了分析，為相應的細胞排隊控制方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎。同時(shí)，建立了基于跨膜電位的單細胞穿孔模型，分析了電場(chǎng)分布態(tài)勢誘導的細胞跨膜電位分布情況，以及該效應下電穿孔區域分布及電穿孔密度分析等；在此基礎上，基于電場(chǎng)聚焦效應，分析了離散式共面電極、弧性凹槽電極、矩形凹槽電極結構參數對電場(chǎng)分布態(tài)勢的影響，探討了各電極結構下細胞跨膜電位分布情況，并從中選取定型了較優(yōu)的凹槽微電極陣列，研制了對應的微流控芯片，從而優(yōu)化了電穿孔/電融合過(guò)程控制，可以有效避免多細胞融合以及改善融合率等。

②細胞電融合微流控芯片的優(yōu)化在理論分析和仿真計算基礎上，從芯片結構、材料、加工工藝、封裝等方面對細胞電融合芯片進(jìn)行優(yōu)化設計，研制了三種芯片:基于薄膜電極、基于離散式共面電極、基于離散式凹槽電極的細胞電融合芯片。在材料選擇上主要采用低阻硅、金、鋁作為電極材料，采用聚酰亞胺多聚物、“Si O2-多晶硅-Si O2絕緣槽”+“浮地硅”結構填充兩相鄰凸齒狀微電極之間的凹陷區；選擇了石英玻璃、SOI等材料作為芯片基底；同時(shí)選擇了軟光刻、IC工藝等制造工藝。這一系列芯片在實(shí)驗中表現出良好的生物相容性、抗化學(xué)腐蝕性及電氣性能等。

③基于微流控芯片的細胞電融合系統平臺的建立根據實(shí)驗要求，利用細胞電融合芯片和細胞電融合儀，搭建了基于微陣列電極芯片的細胞電融合系統平臺。該實(shí)驗平臺具有操作簡(jiǎn)便、可控性好、實(shí)驗效果好等特點(diǎn)。通過(guò)顯微鏡和CCD構成的圖像觀(guān)察和采集系統，可以清晰觀(guān)察并記錄細胞電融合的全過(guò)程，并且實(shí)驗中可根據融合情況隨時(shí)調整融合參數，獲得理想的排隊效率及融合效率。

④微流控芯片上細胞電融合驗證實(shí)驗研究及分析利用基于微流控芯片的細胞電融合系統平臺研究了多種細胞的排隊、融合實(shí)驗條件和參數，包括K562細胞、NIH3T3細胞、成肌細胞等。新研制的芯片解決了細胞吸附在凹陷區無(wú)法融合這一問(wèn)題。此外，這些新設計的微電極也使電場(chǎng)更加集中，降低了排隊電壓和融合電壓。通過(guò)反復實(shí)驗探索獲得了細胞排隊及融合所需的電參數，并且得到了較高的細胞排隊率與細胞融合率。相對于PEG方法和傳統電融合法，新設計的微電極芯片的排隊及融合效率有了顯著(zhù)提高，其中在薄膜電極芯片上K562細胞兩兩排隊效率為70.7%，融合率達到大約43.1%的水平；在離散式共面電極芯片上，幾乎100%的NIH3T3細胞排列在電極上，兩兩排隊效率達到69.8%，融合效率達到40%；在離散式凹槽電極芯片上，98%的NIH3T3細胞進(jìn)入凹槽，大約67.9%凹槽內的細胞兩兩排隊，融合效率達到了50.3%。

總之，通過(guò)對細胞電融合芯片的優(yōu)化設計，本論文研制出高排隊效率、高融合率的細胞電融合芯片，建立了集成融合芯片及電融合儀的細胞電融合微系統實(shí)驗平臺。在對多種細胞的電融合實(shí)驗中，取得了較好的實(shí)驗效果。該研究為建立高效、自動(dòng)的細胞融合芯片系統奠定了基礎，有望進(jìn)一步應用于實(shí)際研究，如雜交育種、體細胞再程序化等。